DIAGNOSTIKA LIKVORHEY

 

Adam P., Sobek O.

Nemocnice Na Homolce, Roentgenova 2, Praha 5

 

   Diagnostika likvorhey přestavuje závažný problém v neurologii, neurochirurgii i ORL. Dosavadní diagnostika pomocí hodnocení cytologického nálezu z dodaného biologického materiálu, včetně hodnocení parametrů biochemických, tj. glukosy, celkové bílkoviny, kalia, chloridů, aj., je v řadě případů nespolehlivá a velmi často spolehlivou diagnosu likvorhey neumožňuje.

   V současné době zavedla naše laboratoř rutinní diagnostiku likvorhey pomocí stanovení koncentrace Beta Trace Proteinu ve sledovaném vzorku biologického materiálu a v séru pacienta. Analýza je prováděna imunonefelometricky na analyzátoru BN II firmy DADE Behring a umožňuje velmi spolehlivou diagnostiku likvorhey. Velikou výhodou metody je jednak její časová nenáročnost, jednak vysoká spolehlivost.

 

 

STANOVENÍ PRODUKTŮ POKROČILÉ OXIDACE PROTEINŮ (AOPP)

U NEMOCNÝCH S AKUTNÍM KORONÁRNÍM SYNDROMEM

 

Adamovská S, Stejskal D, Škvařilová M, Lukl J, Richter M, Juráková R, Prošková J,  Zuber R, Andelová K

Oddělení laboratorní medicíny Nemocnice Šternberk, Jívavská 20, 78516, a I.interní klinika, Fakultní nemocnice Olomouc

 

Úvod: Oxidační stres zhoršuje endoteliální dysfunkci a pravděpodobně hraje i významnou roli v  patogenezi akutních kardiovaskulárních příhod. Jeden z možných markerů oxidačního stresu je tzv. produkt pokročilé oxidace proteinů (AOPP).

Cíl práce: porovnání hladiny AOPP u (1) kontrolní skupiny jedinců bez ICHS, (2) se stabilní anginou pectoris, (3) s chronickým koronárním syndromem, (4) u nemocných s AIM s elevacemi ST segmentu.

Metodika: Byla stanovena koncentrace AOPP  ve vzorcích krve odebraných během koronarografie v různých lokalizacích. Provedena analýza koronarografie, rizik. faktorů a anamnestických dat.

Výsledky a závěr: Vyšetřeno 67 probandů,  prům.věku 63,7 roků. 1.Nebyl nalezen významný rozdíl mezi vzorky ze žilní krve a věnčitých tepen ani mezi infarktovou a neinfarktovou tepnou u 4. skupiny. 2. Hodnoty AOPP se významně lišily v jednotlivých skupinách (průměry ukat/l – a.coron.l.sin: 1. = 82,6; 2. =74,8; 3. 110; 4. =190,6; a.coron.l.dx.: 1.= 88 ;2 =78,7 ; 3.=115,7; 4=178,9; p<0.05). 3. Byla prokázána korelace mezi AOPP a údajem nikotinismu (k.koef 0,44, p=0,002) a negativní korelace s LVEF (k. koef  -0,39, p=0,03). Kuřáci a hypertonici měli hodnoty AOPP významně vyšší (p<0,01).

Závěr: Získaná data podporují hypotézu, že se oxidační stres může podílet na vzniku akutního koronárního syndromu. Skutečnost, že se hodnoty AOPP neliší v infarktové/neinfarktové tepně a periferní cirkulaci považujeme za zásadní, pro ev. další diagnostické využití i za výhodnou. Podobné údaje zatím nebyly publikovány.  Zdá se, že stanovení AOPP lze využít jako ukazatel oxidačního stresu i jako prognostický faktor pro vznik závažných forem kardiovaskulárních příhod.

 

 

PATOGENEZE DIABETES MELLITUS

 

Bárová H.

III. interní klinika VFN, U Nemocnice 1, Praha 2, 128 00

 

   Diabetes mellitus (DM) je podle definice WHO metabolické onemocnění různé etiologie charakterizované chronickou hyperglykémií s poruchou metabolismu sacharidů, lipidů a proteinů, která je způsobené porušenou syntézou nebo sekrecí inzulínu, porušeným účinkem inzulínu nebo obojím. Příčinou hyperglykémie je snížený vstup glukózy do buněk tukové a svalové tkáně, snížená utilizace glukózy (glykolýza) a zvýšená glykogenolýza a glukoneogeneze v játrech. Nadprodukce glukózy v játrech (mechanismem glykogenolýzy a glukoneogeneze) je způsobena nadbytkem glukagonu relativně k množství funkčního inzulínu. Nová WHO klasifikace diabetu z roku 1998 rozeznává diabetes mellitus 1. a 2. typu, gestační diabetes a ostatní typy diabetu.

   DM 1. typu je způsoben autoimunitní destrukcí beta buněk, která vede k absolutnímu deficitu inzulínu. Onemocnění vzniká u geneticky predisponovaných osob, přitom autoimunitní reakce je spuštěna vlivem určitých nepříznivých vnějších faktorů, což mohou být některá virová onemocnění, stres atd. Byla identifikována celá řada beta-buněčných molekul (autoantigenů), proti kterým je namířena autoimunitní reakce, z nichž nejdůležitější jsou dekarboxyláza kyseliny glutámové (GAD), insulinoma antigen 2 (IA-2) a inzulín. Stanovení protilátek proti těmto antigenům je využíváno v diagnostice diabetu 1. typu.

   DM 2. typu je nejčastější typ diabetu. Na jeho vzniku se podílí porušená funkce beta buněk – porucha sekrece inzulínu a snížená senzitivita periferních tkání na působení inzulínu – inzulínová rezistence. Obě poruchy mají genetický podklad a plně se rozvinou pod vlivem určitých nepříznivých vnějších faktorů. Hlavním rizikovým faktorem je obezita, která způsobuje a zhoršuje inzulínovou rezistenci. Inzulínová rezistence může mít několik příčin: snížení počtu (down-regulace) inzulínových receptorů, porucha receptoru a nejrůznější postreceptorové poruchy (přenos signálu z receptoru do nitra buňky). Inzulínová rezistence vede ke kompenzatorní zvýšené produkci inzulínu – hyperinzulinémii. Zvýšená sekrece inzulínu postupně „vyčerpává“ beta buňky, rozvíjí se dysfunkce beta buněk s poruchou sekrece inzulínu. Svou roli obvykle hrají i funkční geneticky podmíněné defekty beta buněk. Také chronická hyperglykémie působí toxicky na beta buňky a dále zhoršuje jejich funkci (tzv. glukotoxicita). Rovněž zvýšená hladina mastných kyselin působí nepříznivě na funkci beta buněk (tzv. lipotoxicita).

   Na rozvoji gestačního diabetu, který se rozvíjí v těhotenství, se pravděpodobně podílí nadměrné přibývání na váze (rozvoj inzulínové rezistence) a zvýšená hladina kontraregulačních hormonů (HPL, kortisol) u geneticky predisponované ženy.

Patogeneze ostatních typů diabetu je různorodá. Patří zde onemocnění podmíněná genetickými poruchami beta buněk či inzulínu, zničením beta buněk u sekundárního diabetu při chronické pankreatitis a jiných onemocněních pankreatu, a rovněž diabetes způsobený zvýšenou hladinou kontraregulačních hormonů, jako je tomu u různých endokrinopatií (Cushingův syndrom, akromegalie, feochromocytom, glukagonom, hypertyreóza, somatostatinom).

 

 

NOVÉ TRENDY VE SCREENINGU VVV

 

Bezdíčková D., Zima T., Malbohan I.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK, Praha

 

   Screening Downova syndromu (DS) a rozštěpu neurální trubice (NTD) ve II. trimestru těhotenství použitím double nebo triple testu je rozšířený a poměrně dobře organizovaný v rámci celé republiky. I přes relativně vynikající výsledky, a to i v porovnání s ostatními zeměmi evropského regionu, je třeba si přiznat, že tento postup má svá omezení a výtěžnost se pohybuje celorepublikově kolem 65% prenatálně diagnostikovaných případů Downova syndromu.

   Snahou se stává rozšíření screeningu do časnějších fází těhotenství a tím i podstatné zvýšení výtěžnosti prováděného vyšetřování. Navrhovaný systém počítá s poměrně úzkou spoluprací gynekologů, genetiků i pracovníků laboratoře, která ovšem při dnešních možnostech komunikační techniky není problémem. Postup spočívá ve spojení výsledků vyšetřování v I. a II.trimestru, takzvané integraci screeningu. Mezi 9. a 11. týdnem se v séru těhotné stanoví hladina specifického těhotenského proteinu PAPP-A. Okolo 12.týdne se provede specializovaný UZ s měřením nuchální translucence (NT). Zároveň se stanoví velmi přesně stáří plodu a vyhodnotí se výsledky. V 16.týdnu se stanoví hCG a AFP v séru matky, provede se hodnocení jako dosud a zároveň se společně vyhodnotí i výsledky z I.trimestru. Lze očekávat záchyt až 90% postižených těhotenství při vyžívání integrovaného  screeningu.

   Často se vyskytuje hypothyreóza, která není diagnostikována a může ohrozit rozvoj dítěte. Z odebrané krve pro screening je vhodné zároveň vyšetřit i funkci štítné žlázy stanovením hladiny TSH a FT4, případně protilátky proti peroxidáze TPO. Je známo, že děti matek s neléčenou hypothyreózou mají signifikantně snížený IQ.

      Pokud budou všechny odběry dobře organizovány a spojeny, je možné dosáhnout minimální zátěže těhotné při maximální výtěžnosti screeningu.

 

 

KVANTIFIKACE HBV DNA U PACIENTŮ S CHRONICKOU HEPATITIDOU B

 

Blažková J., Plíšková L.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice, Hradec Králové

 

 

   Kvantitativní stanovení HBV DNA se používá ke stanovení virémie před eventuální léčbou chronické virové hepatitidy B v replikační fázi, k monitorování virové nálože při antivirové léčbě a k průkazu replikační fáze HBV. Využití PCR metod (včetně real-time PCR) pro kvantitativní stanovení HBV DNA výrazně zvýšilo citlivost oproti hybridizačním technikám. Cílem naší práce bylo stanovit sérové hladiny HBV DNA v různých stadiích onemocnění chronickou hepatitidou B a vypočítat rozlišovací mez (cutoff) mezi replikační fází viru hepatitidy B a integrovanou formou HBV s reziduální replikací viru. Ke stanovení HBV DNA jsme zavedli a optimalizovali real-time PCR metodu na přístroji LightCycler (Roche).

   Soubor pacientů: 68 pacientů našeho sledovaného souboru jsme rozdělili do 3 skupin dle sérologických markerů replikace viru: 1. sk. tvořilo 27 pacientů s chron. hepatitidou B v replikační fázi (HBsAg poz., HBeAg poz./antiHBe neg), 2. sk. 23 pacientů s chronickou hepatitidou B po navozené sérokonverzi po léčbě antivirotiky (HBsAg poz, HBeAg neg/antiHBe poz), 3. sk. 18 pacientů – bezpříznakových nosičů (HBsAg poz, ostatní sérologické markery neg.). Kontrolní skupina se skládala z 10 pacientů  s odlišnou diagnózou. Pacientům bylo odebráno 2-5 ml srážlivé krve, separované sérum bylo uskladněno při –20⁰ C.

   Metody: HBV DNA byla izolována ze séra kitem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Kvantifikace HBV DNA byla provedena metodou real-time PCR (použita sonda formátu FRET) na přístroji LightCycler.

   Výsledky: V 1. sk. pacientů byla naměřena průměrná hodnota HBV DNA 1,95 x 10⁸ kopií HBV DNA/ml séra, ve 2. sk. 6,39 x 10⁴ kopií HBV DNA/ml séra, ve 3. sk. 1,46 x 10³  kopií HBV DNA/ml séra, ve 4. kontrolní skupině HBV DNA nebyla detekována. ROC analýza určila optimální diagnostickou rozhodovací mez (cut-off) hladiny HBV DNA mezi pacienty s chronickou hepatitidou B v replikační fázi (sk. 1) a pacienty s integrovanou HBV DNA (sk. 2 a 3) o hodnotě 4,2 x 10⁵ kopií HBV DNA/ml séra. Data AUC (plocha pod křivkou) = 0,995, +LR (pozitivní věrohodnost testu) = 26,00, senzitivita testu = 100% a specifičnost = 96% svědčí pro vysokou správnost10⁸ kopií HBV DNA/ml séra metody.

   Metoda stanovení HBV DNA na LightCycleru je vhodná pro kvantifikaci HBV DNA u pacientů před léčbou, k průkazu replikační fáze HBV a pro monitorování HBV DNA v průběhu léčby antivirotiky.

 

 

LABORATORNÍ ZABEZPEČENÍ A KREVNÍ SKLAD 6.POLNÍ NEMOCNICE AČR: BHL-PN.

 

Bohoněk M., Markovina T.

Ústřední vojenská nemocnice Praha, U vojenské nemocnice 1200, 16902 Praha 6

 

   V květnu 1999 byla uvedena do provozu 6.polní nemocnice Armády České republiky v Albánii začleněná do sil AFOR, posléze její část plnila humanitární úkoly v zemětřesení postiženém Turecku. Operovala v  Afganistánu v rámci mise ISAF. Úkolem nemocnice je zdravotnické zabezpečení vojsk, současně s poskytováním odborné lékařskou péči místnímu obyvatelstvu, běžencům a plnění humanitárních úkolů na úrovni ROLE 3

   Součástí nemocnice je laboratorní modul v kontejneru ISO 1C označen jako BHL-PN pro  provádění biochemických a hematologických stanovení v širokém spektru a plnění funkce krevního skladu. Logistickým zabezpečením není laboratoř určena k samostatnému nasazení.

    Při výstavbě se kromě odborných potřeb vycházelo z náročných klimatických a geografických podmínek působení 6.PN, kterým musí odpovídat především robustnost a spolehlivost přístrojů a používaných laboratorních metodik. Výrobcem deklarovaný rozsah okolních teplot, ve kterém lze BHL-PN provozovat je od –30°C do + 44°C, v Afganistánu ale úspěšně pracuje i při okolních teplotách blížících se +60°C. BHL-PN je konstruována pro současnou práci 2 laborantek.

   Biochemická stanovení jsou založena výhradně na metodikách „suché chemie“, která jediná může zaručit stabilitu a reprodukovatelnost prováděných testů v nepříznivých podmínkách. BHL-PN je vybavena zcela novými typy analyzátorů. Jedná se o zařízení Vitros Ortho, kde k dispozici též modul na stanovení hladin minerálů a dále Picollo Abaxix, které bylo původně vyvinuto pro potřeby vesmírných programů NASA. Hodnoty ABR jsou měřeny na malých ručních přístrojí i-STAT ABBOTT.

   Pro vyšetření krevního obrazu byl pořízen klasický hematologický analyzátor nižší třídy s 3 populačním diferenciálem ABBOTT. Jako záložní přístroj slouží centrifugační analyzátor krevního obrazu QBS II Becton and Dickinson. Koagulace jsou měřeny na jednoduchém dvoukanálovém koagulometru.

    Krevní sklad BHL-PN je vybaven kombinovaným chladničkou a mrazničkou boxem Jouan, který umožňuje skladovat za předepsaných podmínek až 500 T.U. transfuzních přípravků a rozmrazovačem plazmy Tool. Laboratoř imunohematologie je postavena na systému gelové aglutinace DiaMed. Transfuzními přípravky byl sklad zásobován ve 4 týdenních intervalech z Oddělení hematologie, biochemie a krevní transfuze ÚVN Praha. Přeprava byla zajišťována v isotermických aktivních boxech Electrolux RCB 42P a isotermických pasivních boxech české výroby TB 16. Přepravní teplota je během transportu monitorována pomocí registračních termometrů Commet.

   Z dalších zařízení je v BHL-PN stolní centrifuga Jouan, laboratorní mikroskop a PC  v odolné protiprachové a protinárazové konstrukci se zesíleným chlazením a 2mi HD, kterým je obsluhován laboratorní informační systém INFOLAB s on-line napojenými analyzátory.

   BHL-PN je klimatizována, svrchu je kontejner ještě opatřen protisluneční clonou.

Vstupní část do laboratoře je oddělena od vlastního pracovního prostoru dveřmi a obsahuje místo pro odběr vzorků (venepunkce) a sprchový kout pro personál.

 

 

VÝSKYT HIV/AIDS V ČR A VE SVĚTĚ

 

Brůčková M.

SZÚ Praha

 

   Ke konci roku 2002 organizace UNAIDS a WHO vydaly odhadovaná čísla výskytu HIV/AIDS ve světě. Celkový počet osob žijících s HIV/AIDS koncem roku 2002 činí 42 milionů. K témuž datu žije ve světě 3,2 milionu dětí do 15 let, které byly infikovány většinou  přenosem HIV z matky na dítě. Jenom v roce 2002 bylo nově infikováno HIV 5 milionů dospělých a dětí. Na HIV/AIDS zemřelo v tomto roce 3,1 milionu dospělých a dětí. Nejvyšší výskyt HIV/AIDS je stále zaznamenáván v subsaharské Africe, nicméně varující jsou čísla z centrální a východní Evropy, kde v současné době probíhá explozivní epidemie HIV/AIDS především mezi injekčními uživateli drog.

   Česká republika patří dosud mezi země s nejnižším výskytem HIV/AIDS s celkovou prevalencí 58,5 případů na milion obyvatel. K 31.12.2002 bylo v ČR registrováno celkem 601 případů infekce HIV, u 163 infikovaných bylo diagnostikováno klinické onemocnění AIDS. Nejčastějším způsobem přenosu HIV zůstává v ČR, na rozdíl od některých východo- a západoevropských zemí, sexuální styk; více než 82% HIV pozitivních osob se infikovalo při sexuálním styku. Přes 20% HIV infikovaných tvoří ženy, 7% z nich bylo zachyceno při rutinním testování gravidních žen. U tří ze 46 novorozenců HIV infikovaných žen došlo k přenosu HIV, všechny tyto děti dosud žijí.

   Velkým problémem je v současné době HIV infekce diagnostikovaná u cizinců, zejména u migrantů z východní Evropy. Jejich počet každoročně stoupá, řada z nich provozuje na území ČR prostituci (ženy), nebo je stíhána pro trestnou činnost (muži).   31.12.02 bylo v ČR diagnostikováno 178 cizinců, v posledních letech přicházejících převážně z východoevropských zemí (Ukrajina, Bělorusko, Rusko).

    Problém migrace je problémem celosvětovým, se kterým se musí vyrovnat i Česká republika a to nejen vzhledem k riziku HIV/AIDS.

   V přednášce je dále detailně rozebírána epidemiologická situace v oblasti HIV/AIDS.

 

 

VYUŽITÍ DISKŮ SPEC-C18 – I PRO RYCHLÉ A CITLIVĚJŠÍ GC-MS STANOVENÍ

DELTA-9-TETRAHYDROKANNABINOLOVÉ KYSELINY V LIDSKÉ MOČI

 

Černíková B., Haklová L., Voříšek V.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky, FN, Hradec Králové

 

      Speciální kolonky s rezervoáry SPEC C-18 Cartridges firmy ANSYS původně určené pro přípravu analytického vzorku k separaci sumy kannabinoidů řady delta-9 a delta-8 na tenké vrstvě (komerční metoda značky THC II Screen), byly použity pro přípravu analytických vzorků k GC/MS-stanovení delta-9-tetrahydrokannabinolové kyseliny. Spojení vysoce efektivní extrakce na pevné fázi a analytické síly hmotnostního spektrometru vedlo k podstatnému snížení limitu detekce, který se pohyboval na hodnotě 1.5 ng/ml.

   K extrakci kannabinoidů byl použit vakuový extraktor Visiprep 24 Supelco. Jednoduchý postup zahrnoval nastavení patřičné hodnoty vakua, aplikace 1ml methanolu p.a. na disk. Po prokapání methanolu byly ihned aplikovány předem připravené vzorky (alkalická hydrolýza, okyselení). Po této aplikaci vzorků bylo vakuum zvýšeno na 10-12´´ Hg, aby rychlost průtoku media byla nižší než 2 ml/min. Zároveň ihned po protečení vzorků byla aplikována 20% kys. octová jako proplachovací činidlo. Po protečení kyseliny byl ještě disk vystaven 30 vteřin sušícímu efektu vakua. Disky po vyjmutí z kompletu kolonek byly vysušeny na blokovém termostatu při 100^o C za použití hliníkových kalíšků, do nichž byly disky vloženy. Kalíšky s disky byly v termobloku ponechány 6 minut. Po vysušení byly disky pomocí špendlíku mírně rozdrceny, vloženy do reakčních zkumavek Supelco, a k nim byla přidána reakční směs BSTFA: TMCS = 99:1 o objemu 100 ul na každý disk. Uzavřené reakční zkumavky s takto připravenou reakční směsí byly ponechány 20 minut při 75 ^o C v termobloku.

     Součástí práce bylo porovnání dosažených kvantitativních výsledků této metody s výsledky alternativních dvou metod používaných na našem pracovišti, a to skupinové enzymoimunochemické metody EMIT II Cannabinoids (komerční metoda Dade Behring) a GC-MS stanovení delta-9-tetrahydrokannabinolové kyseliny s použitím extrakce na SPEC C-18 AR na souboru deseti pozitivních vzorků moče. Pro kvantitativní GC-MS stanovení byla monitorována hmota m/z 371.

 

 

NEOBVYKLÉ  NÁLEZY  V  LIKVOROVÉ  CYTOLOGII

 

Černohousová L.,  Ševčíková I., Mrázová K.

ÚKBLD  VFN  a  1. LF UK, Praha

 

     Při odečítání likvorových preparátů se můžeme setkat s poměrně neobvyklými nálezy, z nichž některé  mohou zapříčinit diagnostické rozpaky. Seznámíme vás se třemi zajímavými kazuistikami

 

I. Kazuistika –  náhodná  punkce  kostní  dřeně , muž, věk 63 let

V preparátech zhotovených z likvoru  nalezena smíšená pleocytóza převážně tvořená buňkami monocyto-makrofagického systému. Zachyceny četné nezralé buňky hematopoézy (prakticky všechna vývojová stádia bílé i červené řady). Nejasný nález svědčil nejspíše pro arteficiální kontaminaci materiálu kostní dření. Nelze vyloučit ani možnost akutního zánětu nebo hematologické onemocnění.

 

II. Kazuistika -  lumbální  punkce  post  mortem , dodatečně diagnostikována  vrozená  mitochondriální  vada , dívka, stáří 3 dny

V základním barvení pozorována záplava rozpadajících se, těžko identifikovatelných buněk. Jednalo se nejspíše o fragmenty nekrotické tkáně. V minoritním zastoupení  přítomny neutrofilní granulocyty, makrofágy i pěnité buňky. Ve fragmentech rozpadlé tkáně malá kulatá densní jádra, odpovídající nejspíše lymfocytům. V barvení na lipidy zachyceny ojediněle lipofágy.

 

III. Kazuistika  -  lumbální  punkce  post  mortem,  fulminantní pneumokoková  meningitida, chlapec, stáří 5 let

V preparátech záplava Gram-pozitivních kokoidních útvarů, uspořádaných ve dvojicích, řetízcích či skupinkách, zachycených i intracellulárně. Velmi četné volné erytrocyty, výjimečně i fagocytované. Četné jaderné elementy výrazně regresivně změněné, zastoupeny mononukleární fagocyty, degenerativní formy neutrofilů, nediferencované buňky, ojediněle lymfocyty. Nález potvrzuje diagnózu purulentní meningitidy (pneumokok, event. streptokok).

 

 

ZVÝŠENÍ VIABILITY KRYOPREZERVOVANÝCH PRECIZNÍCH TKÁŇOVÝCH

ŘEZŮ NOVOU TECHNIKOU ZMRAZOVÁNÍ A ROZMRAZOVÁNÍ

 

Červenková K., Rypka M., Veselý J., Snášelová S.

Ústav patologické fyziologie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

 

   Kryoprezervace čerstvé tkáně je velmi účinnou cestou  pro uchování vzácných  tkáňových vzorků.  Po rozmrazení je žádoucí dosažení maximální možné viability řezů. Naše práce zavádí novou techniku kryoprezervace řezů spočívající v jejich rychlým zmrazení a rychlém zpětném přenosu do inkubačního media s minimální dobou tání.

   Tkáňové řezy byly získány pomocí Krumdieckova tkáňového mikrotomu.  Řezy byly napřed inkubovány v mediu obsahujícím 10 % dimethylsulfoxidu a pak  umístěny na hliníkovou folii a zmrazeny v kapalném dusíku. Řezy byly uchovávány jeden až osm týdnů při –80 °C, pak byly  rozmrazeny ponořením folie do media při  37 °C. Viabilita řezů myších jater byla hod-nocena pomocí reakcí s 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromidem (MTT), 7-ethoxykumarinem  (7-EC) a stanovením aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) v řezech a v mediu. Srovnávací skupina řezů byla zmrazena v 1,5 ml polypropylenových zkumavkách  (4 řezy v 1 ml  media),  viabilita byla hodnocena byla stejným způsobem.

   Využitím nízké tepelné kapacity a vysoké tepelné vodivosti hliníkové folie jsme dosáhli ve srovnání s dosud publikovanými údaji asi pětinásobného zkrácení času zmrazení a rozmrazení, při zachování nízké koncentrace kryoprotektivní látky.

   Technika zmrazení  řezů na folii  je rychlou a snadnou metodou kryo-prezervace tkáňových řezů, zajišťující jejich minimální poškození a vysokou viabilitu.

 

 

OCHRANA DAT ŠIFROVÁNÍM A DIGITÁLNÍM PODPISEM - PGP

 

Dohnal L. <ludek.dohnal@lf1.cuni.cz>

Referenční laboratoř pro klinickou biochemii, ÚKBLD VFN a 1.LFUK,  Praha

 

Motto:

Stane-li se soukromí zločinem, jenom zločinci budou mít soukromí.

 

   PGP je zkratka "Pretty Good Privacy", lze ji přeložit jako "docela dobré soukromí". Jedná se o šifrovací program, jehož první verzi vytvořil Phillip Zimmermannn v r. 1991 pro nejširší veřejnost za účelem ochrany soukromé komunikace. Pro nekomerční účely je zdarma (freeware).

   PGP je kombinovaný šifrovací systém. Jeho podstatou je asymetrické šifrování pomocí dvou klíčů, veřejného a soukromého (public and private key). Umožňuje šifrování a/nebo digitální podpisování textů, e-mailů, databasí, obrázků aj., zkrátka jakéhokoliv souboru existujícího v elektronické podobě. Šifrovaný soubor je použitelný pouze pro toho, kdo jej může dešifrovat. Eventuelní připojení digitálního podpisu umožňuje ověřit identitu odesílatele a zkontrolovat, zda obsah dokumentu nebyl cestou mezi odesílatelem a adresátem změněn.

   Uživatel PGP musí mít alespoň jeden pár klíčů - veřejný a soukromý. Ty mu vygeneruje program PGP poté, co zadá kromě své identity - obvykle jména - a elektronické adresy též heslo (passphrase). Heslo je potřebné k používání soukromého klíče, klíč i heslo je dobré držet v tajnosti. Pozor, v případě poškození nebo ztráty je nelze nijak zjistit. Veřejný klíč je naopak použitelný bez hesla a volně dostupný komukoliv. Problémem u něj bývá jeho autentičnost, míra jistoty, že skutečně patří dané osobě.

   Zašifrování se děje pomocí veřejného klíčem příjemce, rozšifrování pomocí soukromého klíče téhož příjemce. Podepsání se děje pomocí privátního klíče  odesílatele, ověření elektronického podpisu pomocí veřejného klíče téhož odesílatele. Na první pohled složité, pokud si to vyzkoušíte, zjistíte, že to složité není.

   Šifrování a digitální podpisování se používá i pro vlastní potřebu. U souboru, který si zašifrujete, máte jistotu, že jej nikdo kromě Vás "jen tak" nepřečte, i když je třeba volně přístupný. Pokud soubor opatříte digitálním podpisem, máte kontrolu nad tím, kdyby jej někdo změnil či podvrhl.

 

Literatura http://www.pgp.cz/

 

 

KLADY A ZÁPORY  VYUŽÍVÁNÍ INFORMATIKY V NAŠEM OBORU

 

Fischer J.

 

Současné století bývá charakterizováno jako století informatiky. Příspěvek se snaží postihnout rozdíly mezi klasickým přístupem k informacím a moderním přístupem po mocí internetu. Poukazuje  nejen na hlavní problémy obou přístupů, ale i omezení svázané s naším oborem.

 

 

ORGANIZACE PŘÍJMU MATERIÁLU V LABORATOŘÍCH V NÁVAZNOSTI NA ZLEPŠENÍ SPOLUPRÁCE S LŮŽKOVÝMI A AMBULANTNÍMI ODDĚLENÍMI

 

Frýbová D., Chrastil V., Klemensová V.

ÚKBP, ÚKI, ÚKM - FN Motol, V Úvalu 84, 160 00, Praha 5

 

V naší společné práci jsme se pokusili definovat největší problémy vznikající z práce při příjmu materiálu v laboratořích. Pokusili jsme se najít chyby v preanalytické fázi a následně jsme navrhovali jejich řešení v souladu se správnou laboratorní prací. Pokusili jsme se definovat pravidla a vzájemné vztahy mezi námi – laboratořemi a dalšími subjekty – lékaři, sestrami lůžkových a ambulantních oddělení, jinými laboratořemi a samotnými pacienty.

 

 

VYŠETŘENÍ MOZKOMÍŠNÍHO MOKU U DĚTSKÝCH PACIENTŮ - ZKUŠENOSTI Z

LABORATORNÍ PRAXE.

 

Glosová R.

Neurologická klinika 2.LF UK a FN v Motole, Praha

 

   Úvod se zabývá krátkým přehledem z fyziologie a anatomie mozkomíšního moku. Laboratorní vyšetření této vzácné humorální tekutiny zasahuje do mnoha různých oborů.  Mezi základní indikace pro vyšetření mozkomíšního moku patří záněty centrální nervové soustavy, subarachnoidální krvácení a některá nádorová onemocnění.

   Normální složení mozkomíšního moku se v zásadě neliší u starších dětí a dospělých. Jen u novorozenců se mohou vyskytnout některé zvláštnosti, například nezralé buňky nebo vysoká bílkovina. Několik příkladů vyšetření mozkomíšního moku u dětských pacientů s meningitídou, herpetickou encefalitídou, neuroboreliózou, meduloblastomem a retinoblastomem dokumentuje jeho význam.

   V závěru jsou zdůrazněny některé jednoduché zásady pro zacházení s mozkomíšním mokem .

 

 

PRAKTICKÝ POSTUP PŘI ZPRACOVÁNÍ VZORKU MOZKOMÍŠNÍHO MOKU

 

Hejduková H., Ševčíková I., Mrázová K., Zeman D.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK

 

Předkládané sdělení stručně shrnuje postup při zpracování vzorku likvoru zejm. ve statimovém laboratorním provozu: 1/ Kontrola identifikačních údajů. 2/ Posouzení vzhledu likvoru – čirý bezbarvý, sangvinolentní (krvavý), xanthochromní (žlutavý), zkalený. 3/ Šetrné promíchání. 4/ Oddělení části materiálu pro biochemická vyšetření – tuto vždy centrifugujeme (i když je čirý bezbarvý), supernatant odpipetujeme do čisté zkumavky, opět posoudíme vzhled (význam zejm. u krvavého likvoru: po centrifugaci čirý bezbarvý = asi arteficiální krevní příměs, xanthochromní = asi krvácení do likvorových cest). Provedení vlastních biochemických vyšetření: spektrotometrie (je-li požadována), Pandy (orientační reakce na celkovou bílkovinu), stanovení celkové bílkoviny, glukózy, laktátu. Nutno zachovat materiál pro další speciální vyšetření (základní imunochemické: stanovení albuminu a IgG /IgM, IgA/ v moku a zároveň v séru, není-li s likvorem dodána krev, vyžádat její dodatečné zaslání; stanovení plazmatických proteinů pouze v likvoru je diagnosticky i ekonomicky nesmyslné). 5/ Cytologické vyšetření:  materiál nesmí být centrifugován! K počítání jaderných buněk (elementů) a erythrocytů (ery) se většinou užívá Fuchs-Rosenthalova komůrka o objemu cca 3 ml a výsledek udáváme zlomkem (např. 5/3 elementů = 5 elementů v komůrce). Ery počítáme nejlépe neobarvené (nativní),  elementy lépe vyniknou při obarvení (např. roztokem kyselého fuchsinu). Počet elementů i ery musí být vždy vyjádřen číselně, při nálezu “záplavy” (zprav. ery) nutno likvor adekvátně zředit fyziologickým roztokem a počet elementů a ery aspoň přibližně stanovit. Diferenciace elementů na mononukleáry a polynukleáry je málo spolehlivá, doporučujeme od ní upustit, je-li možnost zhotovit trvalý cytologický preparát cytosedimentací nebo cytocentrifugací. Postup přípravy preparátů závisí na zvolené metodě. Při řádově zvýšeném počtu elementů nebo  masívní krevní příměsi množství aplikovaného likvoru úměrně redukujeme. Základní barvící metodou je přehledné Pappenheimovo barvení (May-Grünwald/Giemsa), při podezření na bakteriální meningitidu lze provést Gramovo barvení, event. další speciální barvení podle indikací.

 

 

STATISTICKÉ METODY POROVNÁVÁNÍ LABORATORNÍCH METOD

 

Hendl J. <hendl@ftvs.cuni.cz>

Katedra základů kinantropologie a humanitních věd, FTVS UK, Praha            

 

   Porovnávání metod se provádí, pokud chceme zhodnotit  vzájemnou shodu mezi dvěma metodami, které měří stejnou veličinu. Obvykle se provádí srovnání nově navržené metody s  metodou již zavedenou nebo s tzv. referenční či definitivní metodou, což je metoda, která představuje aktuálně nejlepší metodu vzhledem k parametrům správnosti (systematická chyba) a přesnosti (opakovatelnost výsledků). Srovnání se provádí pomocí dat, která se získala změřením určitého počtu objektů (např. vzorků krve nebo jedinců) oběma metodami současně.  Měření na jednom objektu se provádí jednou nebo  několikrát, s cílem získat lepší odhady přesnosti metody nebo průměru změřené hodnoty u daného objektu. Někdy se popsaný sběr dat nazývá srovnávací experiment.

   Při zpracování takových dat se využívají grafické metody k vhodné vizualizaci dat a různé statistické metody k numerickému odhadu vztahu mezi oběma metodami a přesnosti takového odhadu. V biomedicínské literatuře se  téma výběru a používání grafických a statistických technik objevuje poměrně často. Studie o hodnocení nových metod měření  jsou totiž pozorně sledovány odbornou veřejnost. Klinické rozhodování je obvykle závislé na velkém množství parametrů, které se měří nejrůznějšími metodami (v závislosti na výrobci, použitém principu, potřebné kvalitě, kapacitě, rychlosti, robustnosti, ekonomické náročnosti atd.) v mnoha typech klinických laboratoří (Hendl, Kratochvíla 1983). Je proto žádoucí rozvinout metodologii srovnávání metod, zvláště její statistickou část.

   Cílem je přehledně charakterizovat a vyhodnotit některé novější metodologické poznatky o používání  statistických technik pro vyhodnocení dat z porovnávacích pokusů, které se týkají kvantitativních metod měření.

 

Literatura

BLAND, J.M., ALTMAN, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet, 1986; 1, s. 307–10.

HENDL, J., KRATOCHVÍLA, J.  Statistické principy vyhodnocování kvality laboratorních metod. Praha : Knižnice Institutu pro další vzdělávání lékařů, 1983.

HOLLIS, S. Analysis of method comparison studies [Editorial]. Ann. Clin. Biochem., 1996, 33, s.1–4.

MARQUIS, P. Method Validator. A computer programm. (www.marquis-soft.com, vystaveno 24.4.2002)

J. Clin. Chem. Clin. Biochem.,1984, 22, s.431-445.

WESTGARD, J.O. Points of care in using statistics in method comparison studies [Editorial]. Clin. Chem., 1998, 44,  s.2240-2242.

 

 

MOTIVACE JAKO SOUČÁST SYSTÉMU ŘÍZENÍ KVALITY KLINICKÉ

LABORATOŘE SE ZAMĚŘENÍM NA AKREDITACI

 

Hlaváčková H., B. Friedecký

ÚKBD Fakultní nemocnice Hradec Králové, přednosta Prof. Mudr. V. Palička, CSc.

 

          Proces akreditace laboratoře lze dovést k úspěšnému závěru pouze vědomou spoluprací motivovaných pracovníků a zajistit tím splnění veškerých požadavků daných určenými normami kvality.

         Příspěvek rozebírá teoretické základy motivace, hierarchii potřeb a jejich uspokojování s přihlédnutím k nejdůležitějším atributům  - stanovení cílů, rozdělení pravomocí a odpovědností, styl vedení a osobnost manažera, atmosféra na pracovišti, systém oceňování a odměňování, osobnostní rozvoj s nezastupitelnou rolí komplexní informovanosti.

         Motivace vedle schopností a způsobilosti členů týmu, vhodných pracovních a organizačních podmínek zajišťuje požadovaný výkon, kvalitu, jakost a včasnost provedení všech činností.

        „Umění motivovat a vést pracovníky ke splnění žádaných cílů je největší manažerské umění vůbec.“    

 

 

KVANTITATIVNÍ A KVALITATIVNÍ RT-PCR A  GENOTYPIZACE HCV

PRO DIAGNOSTIKU A MONITOROVÁNÍ TERAPIE HEPATITIDY C

 

Horák P. , Matoušková D.

OKB Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem

 

   Techniky průkazu virové RNA ve vzorcích krevního séra či plazmy za pomoci RT-PCR představují efektivní nástroj v diagnostice a monitorování terapie hepatitidy C.
Jsou demonstrovány zkušenosti s vyšetřováním antigenu hepatitidy C na OKB Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem s použitím automatizovaného PCR systému COBAS MPLICOR a diagnostických souprav firmy ROCHE:
- COBAS AMPLICOR HCV v.2.0 pro kvalitativní průkaz přítomnosti viru HCV dovolující včasný záchyt infekce ještě před imunologickou serokonverzí
- soupravy COBAS AMPLICOR HCV MONITOR v.2.0 umožňující kvantifikaci virové nálože (IU/ml) pro účely monitorování antivirové terapie a stanovení prognozy onemocnění.

   V návaznosti na pozitivní průkaz HCV je pro predikci míry odpovědi na HCV terapii prováděna genotypizace HCV soupravou INNO-LIPA HCV II firmy INNOGENETICS umožňující detekci 6ti základních typů a nejběžnějších subtypů (1a,1b,1a/1b,2a/c,2b,3a-c,4a-h, 5a,6a), z nichž v naší populaci častý subtyp Ib je dle literatury z klinického hlediska nejrizikovější s nejmenší odezvou na terapii interferonem-a.

   Amplifikované RT-PCR produkty značené biotinem jsou v setu INNO-LIPA HCV II reverzně hybridizovány s genotypově specifickými oligonukleotidovými sondami imobilizovanými na nitrocelulozové proužky. Po hybridizaci je přidán streptavidin značený alkalickou fosfatázou a barevná detekce po inkubaci s chromogenním substrátem BCIP/NBT).

   Průkaz jednotlivých genotypů je založen na genetickém polymorfismu na 5´- konci vysoce konzervativního netranslatovaného regionu (5´ -UR)  genomu HCV. Vzhledem ke kompaktibilitě produktů reverzní transkripce a amplifikace u všech tří diagnostických souprav, je možno denaturovaný biotinylovaný amplifikovaný RT-PCR materiál z kvalitativního či kvantitativního HCV testu ROCHE přímo aplikovat pro genotypizaci setem INNO-LIPA HCV II, což přináší podstatné zjednodušení a zrychlení pracovního postupu.

   Na principu koamplifikace vnitřní kontroly v kvalitativním testu ROCHE je výrazně potlačeno riziko falešně negativních výsledků v důsledku inhibice PCR a rovněž proužky pro genotypizaci jsou vybaveny liniemi pro kontrolu úspěšné amplifikace a barevné detekce.

 

 

ZKUŠENOSTI SE ZAVEDENÍM SŘJ PODLE NORMY ISO 9001:2000 NA OKBH VE FN BRNO

 

Horáková H.

OKBH FN-Brno

 

Předkládáme naše zkušenosti s přípravou dokumentů a celého systému řízení jakosti podle požadavků normy ISO 9001:2000.

V této mezinárodní normě jsou specifikovány požadavky na SŘJ v případech kdy organizace:

a) potřebuje prokázat schopnost trvale poskytovat produkt, který splňuje požadavky zákazníka a příslušné požadavky předpisů

b) má v úmyslu zvyšovat spokojenost zákazníka a to efektivní aplikací tohoto systému včetně procesů pro jeho neustálé zlepšování

 

   Popisujeme postup při vytváření dokumentů SŘJ III. úrovně (SOP – analytické, technické a logistické)  II.úrovně ( směrnice), III.úrovně – příručky jakosti.

Podíl jednotlivých členů pracovního kolektivu OKBH na přípravě dokumentů a jejich zavedení do praxe.

   Stanovení politiky a cílů jakosti OKBH , provádění interních auditů a přípravu celého pracoviště na certifikační audit Certifikační společností DET NORSKE VERITAS, který jsme úspěšně absolvovali koncem roku 2002.

 

 

ANTENATÁLNÍ SKRÍNING DOWNOVA SYNDROMU. ÚKOLY SKRÍNINGOVÉHO CENTRA.

 

Hrodějová, I., Pírková M., Hlavová, E.

GENNET CZ, Praha 1, Klimentská 20

 

Při antenatálním skríningu Downova syndromu spolupracuje několik zdravotnických  segmentů vyžadujích koordinaci:  primární prenatální péče, imunoanalytická laboratoř, genetické poradenství a fetální medicína. V našich podmínkách je koordinačním pracovištěm  zpravidla  oddělení  lékařské genetiky  a/ nebo  imunoanalytická laboratoř.

Koordinační pracoviště má tyto hlavní úkoly.

·  Výběr skríningových  markerů

·  Stanovení metody výpočtu rizika

·  Nastavení prahového rizika

·  Koordinace následné péče

·  Epidemiologická kontrola kvality

·  Informační  a školící činnost    

 

 

VYŠETŘENÍ CYSTICKÉ FIBRÓZY MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÝMI METODAMI

 

Hypiusová V., Hrochová K., Palička V.

ÚKBD FN Hradec Králové

 

     Cystická fibróza (CF) je recesivní dědičné onemocnění. Výskyt CF v evropské populaci je zhruba 1: 2500 novorozenců (v ČR 1 : 2700). CF je provázena celou řadou příznaků, které se mezi jednotlivými pacienty svým průběhem mohou lišit. Tato nemoc postihuje mnoho orgánů, nejvíce komplikací vyvolává v plicích,  trávícím ústrojí, játrech a ve slinivce břišní. CF neovlivňuje funkci ledvin, mentální stav a celkový vývoj dítěte. Příznaky CF se mohou objevit kdykoliv v průběhu života. Většinou jsou diagnostikovány během prvních dvou let života dítěte. Klinická diagnóza CF se potvrzuje laboratorně pomocí tzv. potního testu – stanovení koncentrace chloridů v potu. V současné době může molekulárně-genetické vyšetření určit většinu mutací způsobujících CF.

     Molekulárně-genetické vyšetření CF v naší laboratoři  

Materiál: plná krev, plodová voda, tkáň, buňky získané výtěrem ústní dutiny. Od ledna 1999 jsme provedli 327 vyšetření z krve a 3 z plodové vody.

Metody: provádí se vyšetření 30 základních mutací v genu CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) pomocí kitů CFTR 12, 17 (INNOGenetics) na principu reverzní hybridizace.

Výsledky: z celkového počtu 327 vyšetřených vzorků bylo identifikováno 5 homozygotních pacientů pro mutaci DF508, 38 heterozygotních nosičů pro tuto mutaci a 11 heterozygotů pro dalších 6 různých mutací.

     Závěr: použitím molekulárně-genetických metod lze velmi rychle potvrdit či vyvrátit diagnózu CF. Čím dříve je potvrzena klinická diagnóza, tím dříve se může začít s léčebnými postupy. Specializovaná molekulárně-genetická laboratoř provádí vyšetření mutací u pacientů, jejich rodičů, příbuzných.

 

 

OPTIMALIZACE ANALYTICKÉHO POSTUPU A INFORMATIKA

 

Chromý V.

Masarykova univerzita v Brně, Fakulta přirodovědecká, Kotlářská 2, 611 37 Brno

 

      Informatiku také lze definovat jako vědní obor, který studuje cesty, kterými organismy zpracovávají informace. K optimalizaci libovolného výrobku/postupu se využívají údaje získané pomocí informatiky. Po vybrání klíčových pojmů se začíná literární rešerší z terciárních a sekundárních zdrojů (referátové žurnály) a přechází se na zdroje primární (sdělení, články, publikace, patenty). Informace získaná rešerší může zredukovat počet experimentů nezbytných k optimalizaci a šetří čas i náklady. (To jen strýc František v Jirotkově Saturninovi chtěl vše a od základů objevit v chemii sám).

     Při hledání reakčních podmínek často existuje ze všech možných jen určitá optimální kombinace reakčních parametrů. Metoda postupného měnění parametrů (metoda relaxační) zkoumá odděleně i ty, které spolu souvisí a může vést k nesprávnému závěru. Vhodnější jsou metody multivariační (MVA), kdy se mění a zkoumá víc parametrů současně. MVA vyžadují plán pokusu. Výpočet vzájemně svázaných parametrů lze provést pomocí umělé neuronové sítě (ANN), která napodobuje výpočetní schopnosti biologických systémů použitím velkého počtu jednoduchých, vzájemně propojených neuronů. Je realizována jako výpočetní program, který vyhodnocuje předpovězené a naměřené reakční parametry podle nastavených vah a bias s cílem jejich optimální shody.

     Využití rešerše pro optimalizaci analýzy je ukázáno na stanovení sérové alkalické fosfatasy (ALP). Vyhodnocením rešerše lze např. omezit typy studovaných pufrů, zúžit studovaný interval jejich koncentrací a pH, interval koncentrací substrátu apod. a vybrat vzorky sér. Jako příklad pro využití MVA a ANN je ukázáno hledání optimálního složení inkubační směsi pro fotometrické stanovení sérové ALP (koncentrace pufru, jeho pH a koncentrace substrátu).

 

 

STANOVENÍ HLADINY HOMOCYSTEINU V SÉRU PACIENTŮ

DISPENZARIZOVANÝCH V LIPIDEMICKÉ AMBULANCI

 

Jankujová J., Rybářová H., Trojanovská J., Ploticová V.

FNsP Ostrava – Poruba, tř. 17.listopadu, ÚKB

 

      Vysoká hladina homocysteinu nebo mírné zvýšení je považováno za významný ukazatel časných komplikací aterosklerózy.

   Homocystein je aminokyselina obsahující síru a je intermediárním produktem syntézy cysteinu z methioninu. K tvorbě homocysteinu vedou dvě enzymatické cesty - remethylace a  transsulfurace., kde vitamíny B6, B12 a kyselina listová fungují jako kofaktory. I když role homocysteinu v patogenézi aterosklerózy je diskutována, předpokládá se, že  zvýšení  hladiny homocysteinu v séru má vztah k endoteliální dysfunkci /od vazomotoriky, tvorby kalcifikovaného vulnerabilního plátu, zvýšenou agregabilitu krevních destiček, diskutuje se možný prooxidační efekt HCY na malé  “denzní” LDL částice.

   V současné době je zvýšení hladiny homocysteinu považováno za hlavní nezávislý rizikový faktor srdečního koronárního onemocnění, cévní mozkové příhody, systémových onemocnění pojivové tkáně / ischemická osteonekróza…, / Jako menší RF má vztah k hluboké trombóze arteriální a žilní, současně je popisován vztah k renální insuficienci a demenci .

   Původní aterogenní vlivy homocysteinu byly objeveny u dětí, kde byla zjištěna manifestní ateroskleróza., a to jako projev dědičné metabolické vady označené homocystinurie./autozomálně dominantně dědičné onemocnění/

   Hladina homocysteinu roste běžně s věkem, kouřením, fyzickou inaktivitou, nutriční dyzbalancí.

Vlastní stanovení tohoto parametru jsme provedli  na pracovišti klinické biochemie. Během dvou měsíců bylo provedeno vyšetření dvaceti obézních mužů /BMI nad 30/ ve věku 50 - 60 let, se systolickou a diastolickou hypertenzí, asi 5 let dispenzarizovaných na Lipidemické ambulanci, s dlouhodobě trvající poruchou metabolizmu lipidů /dyzlipoproteinémie - dominantní zvýšení TAG /5-10mmol/l, snížení HDL  /pod l,0mmol/,  čerstvě diagnostikován  diabetes mellitus typu II, hladina homocysteinu se pohybovala od mírného zvýšení až po 30,0mmol/l. Vlastní laboratorní stanovení bylo provedeno na plynovém chromatografu / princip rychlé úpravy a stanovení /  viz poster/

   Výsledky bychom chtěli prezentovat formou posteru, zejména vzájemné korelace biochemických a klinických parametrů s homocysteinem.

 

 

ZMĚNY PRŮTOKU V KOSTERNÍM SVALU, JÁTRECH A LEDVINĚ POTKANŮ, MĚŘENÉ MIKRODIALÝZOU S PŘÍDAVKEM "FLOW MARKERU"

 

Kakrdová D., Hrubá P., Živný P., Živná H., Feřtek D., Kriesfalusyová L., Palička V. Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice v Hradci Králové

Ústav fyziologie, Univerzita Karlova v Praze, Fakulta lékařská v Hradci Králové

 

Cílem studie bylo zjistit změny v  průtoku krve v intersticiu svalů, jater a ledvin pomocí mikrodialýzy s přídavkem tzv. "flow markeru". Průtok byl zjišťován za podmínek fyziologických a po operačním odstranění části orgánu - částečné hepatektomii a částečné nefrektomii. Určení průtoku krve intersticiem vychází z principu, že čím je koncentrace sledované látky (v našem případě lithia, gentamicinu) na výstupu ze sondy nižší, tím je průtok intersticiem vyšší.

Materiál a metody: Do pokusu bylo zařazeno celkem 32 potkanů kmene Wistar ( 250±30 g). U potkanů byla v celkové pentobarbitalové anestesii provedena buď samotná kožní incise a/nebo částečná hepatektomie (odnětí 90 % jaterní tkáně) nebo částečná nefrektomie (odnětí 5/6 ledvinné tkáně). Poté byla zavedena mikrodialyzační sonda CMA 60 (CMA Microdialysis, Solna, Sweden) cut off 20 000 Da. Sonda byla zavedena do kosterního svalu mediální části stehna kontrolních potkanů, dále do konstantních míst jater a ledviny kontrolních potkanů a do svalu, jater a ledviny potkanů po provedených operacích. Mikrodialyzační sonda byla perfundována Ringerovým roztokem s přídavkem lithia perfúzní rychlostí 100 μl/hodinu. Mikrodialyzáty byly odebírány každou hodinu po dobu šesti hodin. Koncentrace lithia byla stanovena plamenovým fotometrem EFOX 5053. Statistická analýza byla provedena pomocí software SigmaStat (Jandel Scientific Corporation).

Výsledky: Průtok svalem u potkanů po odstranění části orgánů poklesl (koncentrace lithia mmol/l na výstupu ze sondy 0,320±0,022 vs. 0,254±0,043), průtok orgány se naopak zvyšoval (koncentrace lithia na výstupu ze sondy 0,285±0,028 vs. 0,387±0,050).

Závěry: Mikrodialýza je vhodnou metodou pro semikvantitativní určování průtoku tkání. Jako tzv. "flow marker" bývá nejčastěji užíván etanol. My jsme zkoušeli přídavek lithia a gentamicinu, tyto látky se ukázaly být vhodné (snadná příprava mikrodialyzačního roztoku, dobrá stabilita - nejde o těkavé látky a mají dobré analytické předpoklady). Zjistili jsme, že po operačním odstranění části parenchymových orgánů (jater, ledvin), dochází ke snížení průtoku krve intersticiem kosterních svalů a ke zvýšení průtoku intersticiem resekovaných orgánů (jaterního nebo ledvinného zbytku).

 

 

MODERNÍ INFORMAČNÍ TECHNOLOGIE A KONTROLA KVALITY V KLINICKÉ LABORATOŘI

 

Kakrdová D., Friedecký B., Malá H.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice, Hradec Králové

 

Poster demonstruje některé možnosti moderních informačních technologií při provádění mezilaboratorního porovnávání.

Předkládáme několik příkladů.

1)  Kontrolní systém EQAS BIO-RAD - zde ukazujeme zadávání a posílání výsledků

     kontrol prostřednictvím elektronické pošty.

2)  Kontrolní systém Evropské referenční laboratoře pro glykovaný hemoglobin těchto

     technologií využívá např. při hodnocení výsledků.

3)  U systému SEKK předvádíme možnost zpětného vyhodnocení použitím

     elektronického archívu výsledků, www.sekk.cz.

4)  Stránky www.vestgard.com jsou předloženy jako ukázka z nesčetných edukačních

     možností v rámci moderních informačních technologií.

5)  Řadu edukačních materiálů, odborných informací, doporučení lze nalézt na

     stránkách www.cskb.cz.

 

 

SLEDOVÁNÍ PACIENTEK S DG.CA CERVICIS UTERI VE FN OLOMOUC

 

Kapustová M., Vočková J., Kotršová L. 

OKBL, Onkol. klinika, GYN-POR klinika FN, Olomouc 

 

Po ca prsu je diagnóza  ca cervicis utery druhou nejčastější příčinou  onkologické mortality žen.Diagnóza tohoto onemocnění je založena na histopatologii. Sérové markery využívané u této diagnózy se zvyšují  většinou  až  s vyšším stadiem nádoru. Hodnoty markerů před zahájením  terapie  mohou být nezávislým prediktorem postižení uzlin.Vysoké hodnoty markerů predikují špatnou prognózu.

 

 

KOMPLIKACE DIABETU MELLITU.

 

Kasalová Z.

III.interní klinika 1.LF UK a VFN, Praha

 

   Diabetes mellitus je chronické onemocnění, které s sebou nese i pestrou paletu komplikací akutních i chronických, které mohou výrazně omezovat kvalitu života pacientů a v krajním případě jejich život i bezprostředně ohrozit.

   Nejčastější akutní komplikací je hypoglykemie. Ta vzniká po aplikaci neadekvátně vysoké dávky inzulínu či perorálního antidiabetika, jedná se vlastně o komplikaci léčby. Projevuje se náhle vzniklou slabostí, opocením, nesoustředěností, pocitem hladu. V těžším případě dochází k poruše vědomí až k hypoglykemickému komatu. Terapeutickým opatřením je podání glukózy perorálně či parenterálně. Další akutní komplikací, zejména u diabetiků 1.typu je hyperglykemické ketoacidotické koma. Diabetes se jím může manifestovat, někdy vzniká při nedostatečné aplikaci inzulínu. V krajním případě se jedná opět o poruchu vědomí, je přítomna dehydratace, hyperglykemie a acidóza. Léčbou je v tomto případě podání inzulínu se současnou hydratací a hrazením kalia. U diabetiků 2. typu může dojít k rozvoji hyperosmolárního hyperglykemického komatu. I v tomto případě léčebně zasahujeme vydatnou hydratací a podáním inzulínu.

   Chronické komplikace vznikají u diabetiků v důsledku dlouhodobě zvýšených hodnot glykémie.  Poškození periferních nervů- diabetická neuropatie- má mnoho nejrůznějších podob, nejčastěji se jedná o necitlivost dolních končetin. Léčebné možnosti jsou minimální. Dalším orgánem, který bývá diabetem zasažen jsou ledviny- diabetická nefropatie je v současné době jednou z nejčastějších příčin chronické renální insuficience a dialyzační léčby. Poškození cév sítnice- diabetická retinopatie, může pacienta připravit o zrak, vzniká naštěstí většinou až po delším průběhu choroby. Provádí se ošetření sítnice laserem. V důsledku kombinace poškození cév, nervů i dalších tkání jsou dolní končetiny diabetiků ohroženy vznikem špatně se hojících vředů- tuto komplikaci nazýváme syndromem diabetické nohy.

 

 

KLINICKÉ ASPEKTY VE VENEROLOGII

 

Kaštánková V.

Dermatovenerologická klinika-STD centrum, VFN a 1.LF UK, U nemocnice 2, Praha 2

 

  Doménou venerologie jsou sice klasické pohlavní choroby ( příjice, kapavka, měkký vřed, lymfogranuloma venereum a granuloma inguinale), nicméně ve spolupráci s ostatními příbuznými obory se zabývá i ostatními sexuálně přenosnými infekcemi. Tyto choroby patří mezi kontaktní nákazy vyvolané odlišnými mikroorganismy. Podle způsobu přenosu se dělí na infekce šířené téměř výhradně pohlavním stykem - kam patří klasické pohlavní choroby a na infekce přenášené převážně pohlavním stykem – podle etiologie způsobeny rozsáhlým  spektrem původců (bakterie, viry, houby, prvoci, zevními parazité, červi).

     Jsou to choroby sociální a v éře infekce HIV/ AIDS představují spolu s rizikovým sexuálním chováním zvýšené nebezpečí získání a přenosu infekce HIV. Prevence HIV/ AIDS spočívá mimo jiné – právě v prevenci, dostupnosti vyšetření, včasné diagnostice a léčbě sexuálně přenosných chorob.

     Mají především vliv na zdraví, ale i na psychiku, partnerské vztahy, ekonomiku, stávají se i politickým problémem při řešení legislativních opatřeních.

Moderní diagnostické metody používané v mikrobiologii, imunologii a virologii se staly součástí diagnostiky těchto infekcí včetně klasických pohlavních chorob. Kombinací těchto nových metod a standardních kultivačních, serologických a mikroskopických metod se neustále zlepšuje diagnostika daného infekčního agens.

   Analýza vývojových trendů syfilis (trvalý vzestup) a gonokokové infekce v posledních letech, organizace péče pro pohlavní choroby, povinnosti pro lékaře a pacienta s obrázkovou dokumentací klinických projevů sexuálně přenosných infekcí dokresluje současnou situaci v ČR.

 

 

ABNORMÁLNÍ NÁLEZ – KOŘENÍ RUTINNÍ PRÁCE  (KASUISTIKA)

 

Klásková R., Fürstová L., Nováčková L.

Ústav klinické biochemie, FNsP Ostrava

 

   Zpestřením všední rutiny je abnormální nález. Pátrání a snaha po vysvětlení představují tvořivou laboratorní práci. Té se nám, v době dramatické automatizace, téměř nedostává.

   Pacient, muž, 22 let. Odeslán obvodním lékařem ke konsiliárnímu vyšetření na nefrologickou ambulanci pro masivní nález celkové bílkoviny v moči bez odpovídajících klinických příznaků. Úvaha o biopsii.

   Ve vzorku sbírané moči naměřena celková bílkovina 2,8 g/l.  Jednotlivé bílkoviny v moči: albumin 11,3 mg/l, transferin 1,0 mg/l,  IgG 2,97 mg/l, alfa1 mikroglobulin, lehké řetězce kappa , lehké řetězce lambda, alfa2 makroglobulin pod mezí detekce. Na elektroforeogramu nezahuštěné moče pozorovány dva gradienty s atypickou pohyblivostí. Jeden migroval v interzóně albumin/alfa1globulin, druhý na anodické straně gama migrační zóny. Vysloveno podezření na simulování proteinurie vaječným proteinem. Podezření potvrzeno pokusem. Do moči - protein negativní - přimícháno definované množství vaječného bílku a znovu provedena elektroforéza. (Vzorek moči pacienta a pokusný vzorek analýza vedle sebe). Byla nalezena jednoznačná shoda frakcí obou elektroforeogramů.

   Elektroforéza je jednoduchá a relativně levná metoda, schopná odhalit atypický protein, případně nasměrovat další pátrání.

 

 

MODERNÍ INFORMAČNÍ ZDROJE PRO KLINICKOU BIOCHEMII,

CD - ROM A INTERNET

 

Kocna P.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK, Praha

E-mail: kocna@lf1.cuni.cz  kocna@mbox.cesnet.cz

 

      Dynamický rozvoj technologií a nových metodik laboratorní medicíny - biochemie, imunologie, hematologie je provázen snad ještě výraznějším rozvojem technologií informačních. Exponenciální rozvoj internetu lze demonstrovat počtem internetových domén, který narůstá každoročně na dvojnásobek. Internet se stává zcela samozřejmou součástí informačních zdrojů i v oboru laboratorní medicíny. Plán realizace státní informační politiky zahrnuje projekt Zdravotnictví on-line, který je řešen v návaznosti na iniciativu Evropské komise "eEurope - An Information Society For All". Kvalitní, informační zdroje on-line dostupné prostřednictvím internetu vytvářejí podmínky pro elektronické, distanční vzdělávání (eLearning, Tele-Education) v pregraduální i postgraduální výuce.

      Elektronické, hypertextově orientované, informační zdroje na CD-ROM médiích nebo dostupné on-line na internetu, umožňují interaktivní přístup k informacím a to v mnohem širším rozsahu než klasické zdroje v tištěné formě. CD-ROM média umožňují ve srovnání s internetem rychlejší přístup k datům, vhodné jsou proto především pro aplikace s animacemi, videosekvencemi a kvalitním obrazovým materiálem. Internetové aplikace nabízejí on-line vazbu s dalšími zdroji, např. databází MEDLINE. Ideálním řešením moderních, hypertextově zpracovaných textů, je kombinace CD-ROM média s kvalitní grafikou a on-line propojení s internetem. Příkladem takto moderně řešených textů, v češtině, je např. Multimediální učebnice DNA diagnostiky, autorem je doc. MUDr. R. Průša CSc.,  Encyklopedie laboratorní medicíny autorského kolektivu doc. MUDr. A. Jabora CSc., nebo Miniencyklopedie laboratorních metod v gastroenterologii, která existuje ve verzi CD-ROM a je dostupná na internetu - serveru 1.lékařské fakulty UK v Praze, URL je http://www.lf1.cuni.cz/~kocna/glab/glency1.htm.

      Na tomto našem projektu je demonstrována moderní forma výukových materiálů - HTML dokumentů. Projekt zahrnuje 45 laboratorních metodik zpracovaných encyklopedickým způsobem, výuková schémata a obrázky v PowerPointu a více než 200 přímých on-line odkazů na nejnovější publikace, abstrakta databáze Medline. V návaznosti na poslední verzi Národního číselníku laboratorních položek jsou vytvořeny on-line hypertextové odkazy do databáze, NČLP, která je dostupná na serveru MZ ČR.  Projekt nazvaný "GastroLab" získal jako jeden z prvních certifikát Asociace zdraví na internetu.

 

 

SEROLOGICKÝ SCREENING NĚMÉ FORMY CÉLIAKIE

 

Kocna P., Vaníčková Z., Dvořák M.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK, Praha

E-mail: kocna@lf1.cuni.cz  kocna@mbox.cesnet.cz

 

   Céliakální sprue (CS, glutenová enteropatie) je autoimunitním onemocněním, u kterého dochází k poškození střevní sliznice a projevům malabsorpce. Céliakie je primárním, malabsorpčním syndromem, je geneticky podmíněna přítomností antigenů HLA II.třídy, nejčastěji DR3, DQ2 a základním etiopatogenetickým agens jsou peptidy vznikající štěpením (enzymatickou hydrolýzou) gliadinů.

      Současné poznatky přinášejí doklady o heterogenitě klinické prezentace tohoto onemocnění. Klasická forma, diagnostikovaná často již v dětském věku, je provázena hubnutím, průjmy a histologickým průkazem atrofické, ploché sliznice tenkého střeva (průkaz enterobiopsií). Po nasazení bezlepkové diety dochází u klasické formy k normalizaci klinického stavu i laboratorních testů. Další formy nejsou běžně diagnostikovány a tvoří téměř 80% případů. Němá forma céliakie je charakterizována patologickými hodnotami serologických testů, a při enterobiopsii nalézáme charakteristické změny histologického obrazu céliakie. Incidence tohoto onemocnění je přibližně 1 : 200 v běžné populaci, a téměř 10x častější (1 : 20) u osob s jiným autoimunním onemocněním, např. diabetes mellitus 1.typu.       

   Serologické markery CS mají význam pro cílenou diagnostiku, dlouhodobé sledování nemocných, kontrolu dodržování diety i pro screening. Laboratorní metody stanovení serologických markerů CS zahrnují antigliadinové protilátky třídy IgA a IgG (AGA-A/G; senzitivita 97,3%, specificita 38,3%), endomyziální protilátky třídy IgA (EmA; specificita 95,7%, senzitivita 78,4%) a protilátky ke tkáňové transglutamináze ve třídě IgA (atTG-A; senzitivita 90,5%, specificita 75,5%) a IgG (atTG-G), vhodné jako doplňkový test v případě deficitu IgA. Diskutovanou otázkou zůstává vlastní diagnostický algoritmus stanovení jednotlivých markerů.  Během 15 let jsme stanovili serologické markery v souboru 4190 vzorků, u 2663 byly stanoveny všechny 4 markery. 1399 vyšetření bylo indikováno pro jinou než gastroenterologickou diagnózu, screeningově, a ve 42 případech jsme prokázali pozitivitu všech 4 CS markerů. U 11 ze 42 nemocných byla provedena enterobiopsie, která v 10 z 11 případů potvrdila totální atrofii sliznice a diagnózu floridní, aktivní céliakie. 

   Podrobné informace o laboratorních metodách v gastroenterologii jsou on-line dostupné na internetu - GastroLab, http://gelab.zde.cz.

 

 

PCS*LIS V PRAXI

 

Kouřil K.

Oddělení klinických laboratoří, Nemocnice Blansko, Blansko

 

   Říká se, že každá rozvinutější technologie je v prvním přiblížení k nerozeznání od magie. Tento příspěvek se proto nezabývá ani výčtem možností nemocničního informačního systému PCS*Care, natož technickými či ekonomickými detaily. Nabízí pohled z první linie, ve které je značně nesourodá masa laboratorních údajů vkládána do struktur database - jednoduše, vstřícně a přitom efektivně. Ale, řečeno slovy klasika: “Takový objekt se nevysráží přes noc v kádince”. Je to výsledek šesti let úprav prováděných občas “in-vivo” ale bez delšího nebo závažného výpadku provozu.

   Kontakt  laborantky se systémem umožňuje uživatelské rozhraní laboratorního modulu. Jedná se o grafické rozhraní database Oracle 8 běžící pod MS Windows. Lze je  individuálně nastavit a tak není nezbytné se prodírat spletí nabídek, ikon a dalších ovládacích prvků. Příjem vzorku se u interních materiálů omezuje na zápis pořadového čísla, výhledově načtením čárového kódu a  kontrolu materiálu včetně množství uvedeného na generované průvodce. Materiály jsou opatřeny laboratorním číslem, případně čárovým kódem s prvky positivní identifikace a předány ke zpracování. Formulář pro externí žádanku je třeba vyplnit. Pro registrovaného pacienta stačí číslo pojištěnce. Příjem žádanek se obvykle provádí na několika pracovních stanicích současně, což práci urychlí. Spolu s metodou lze zadat i výsledek. Pokud není záhlaví čitelné, či je zjevně chybně vyplněno, může být  vzorek zpracován jako neznámý  a potřebné údaje se doplní po upřesnění. Čárový kód lze opakovaně vytisknout.

   Častou akcí je hledání výsledků. Provádí se pomocí filtrů. Dostupná je v případě potřeby třebas i celá database za šest let provozu. Hodnoty jsou barevně a grafickými symboly přehledně rozděleny na rozpracované, zkontrolované, vytištěné a archivní, včetně  hodnocení vzhledem k fysiologickým mezím nebo k předešlým nálezům. K disposici je plný název položky. Výsledky dosud rozpracovaných vzorků vidíme z libovolné pracovní stanice. Telefonicky hlášené výsledky se v systému evidují.

   Menu tisku je uživatelsky definované. Tisková sestava může být opakovaně editována. K nabídce patří i  tisk kumulovaných nálezů, náhled na obrazovku nebo tisk do souboru. Komunikace s externími lékaři prostřednictvím Internetu běží automaticky na pozadí. Sklad, ze kterého laborantka pouze vybírá, nabízí  současně přehled o soupravách a materiálu.

   Veškerá laboratorní dokumentace je přímo a jednoduše dostupná z nabídkové lišty, struktura i šablony dokumentů byly navrženy s ohledem na rychlost a přehlednost.

 

 

VÝTĚŽNOST INFORMACÍ O STANOVENI CRP Z HLEDISKA EXTERNÍHO

HODNOCENI KVALITY

 

Kratochvíla J. <kratochvila.sekk@sekk.cz>

Pístecká 1949, 28802 Nymburk

 

C-reaktivní protein (CRP)  je známým indikátorem zánětlivých stavů včetně infekčních onemocnění. Pokroky v laboratorních technologiích umožňují sledovat i malé změny koncentrace CRP v oblasti < 4 mg.l^-1. V současnosti se využívá sledování malých změn v oblasti nízkých koncentrací CRP převážně k hodnocení rizika kardiovaskulárních onemocnění. O spolehlivosti těchto stanovení tzv. hs-CRP (high sensitive CRP) v oblasti koncentrací 0,1 – 4 mg.l^-1 se vedou diskuse zvláště proto, že biologická proměnlivost CRP je značně vysoká a vyjádřena hodnotami variačního koeficientu dosahuje hodnot

  a   . K tomu přistupují i složky náhodné a analytické proměnlivosti (rozptylu). Vzhledem k významu stanovení CRP se v současné době  začíná rozšiřovat  stanovení CRP jak v klinických zkušebních laboratořích tak i na klinické jednotky v linii prvního kontaktu v souladu s rozhodnutím VZP o proplácení stanovení CRP mimo laboratoř. Nová norma  SRN (Neue Rilibäk 2002) uzákoňuje doporučený toleranční limit (TE_max) pro stanovení CRP na 24 %. Tento limit zahrnuje i požadavky kladené na stanovení metodami POCT a proto jej lze z analytického hlediska považovat za poměrně volný. Povolenou bias a maximální laboratorní nepřesnost vyjádřenou jako CV pro 95% interval spolehlivosti pro toleranční limit 24% a přísnější  limit 21% (vhodný  například pro klinické zkušební laboratoře) uvádí následující tabulka:

 

 

Samostatné kruhové pokusy – mezilaboratorní porovnávání zkoušek (MPZ) pro stanovení CRP se provádějí formou EHK SEKK od roku 1996 a proběhlo jich do konce roku 2002 už 14. Převažuje stanovení imunoturbidimetrické (až 70%), i když se začíná stále více prosazovat imunonefelometrie. EHK se v průběhu let zúčastnilo 63 až 223 klinických laboratoří a v poslední době i klinických jednotek. Byly použity kontrolní materiály výrobců Behring, SERO, Orion a DAKO v širokém rozmezí koncentrací  13,4 – 160 mg.l^-1 CRP. V posledních dvou letech se využívají výhradně kontrolní materiály s návazností na primární referenční materiál CRM 470. Původně byl zvolen pro vyhodnocování kruhových pokusů empirický kontrolní limit - TE_max   (33%) a od roku 2001 doporučená kontrolní mez 24% (Neue Rilibäk 2002).  V průběhu 6ti let provádění MPZ stanovení CRP klesl mezilaboratorní CV_a z původních průměrných 18% ( v roce 1996) na 7% v roce 2002 a zvýšila se výrazně úspěšnost stanovení přes snížení kontrolních mezí a to z 66% (1996) na 91% (pro limit 33% v roce 2000) a 89,7% pro kontrolní mez 24% (v roce 2002).

 

 

SCREENING U DÁRCŮ KRVE

 

Lovecký J., Duchková S.

Adresa: Ústřední vojenská nemocnice Praha, U vojenské nemocnice 1200, 16902 Praha 6

 

   Prezentujeme zhodnocení laboratorního screeningu dárců krve, který se provádí jako povinné vyšetření v zařízení transfúzní služby podle příslušných národních a evropských předpisů. Jedná se o vyšetření vybraných infekčních markerů (HBsAg, anti-HCV, anti-HIV ½, a syfilis) a stanovení hladiny ALT.  Hodnocení zahrnuje výsledky z let 1997 – 2002, kdy se v tomto období na OHBKT ÚVN Praha odebralo a vyšetřilo 48 975 dárců krve. 

   Markery hepatitid se do roku 1999 prováděly metodou ELISA testy Murex na zařízení Dytatech, od roku 2000 imunochemickým stanovením na systému ABBOTT AxSym. Syfilis se vyšetřuje testy Murex (Murex-ABBOTT), do roku 1999 současně metodou na stanovení kardiolipinu i treponemovou (Syfacard a TPHA)  na od roku 2000 pouze metodou TPHA. Stanovení aktivity ALT se provádí fotometricky testy Beckmann na zařízení Beckmann Synchron CX7. 

   Pro potřeby výroby transfúzních přípravků jsou jako přípustné hodnoty u vyšetření infekčních markerů hepatitid a HIV výhradně vzorky s negativním výsledkem povýšeným o 10% nad nulu, tzv. šedou zónu, pro vyšetření TPHA (Syfacard) negativní výsledek, pro stanovení aktivity ALT dvojnásobek stanovené normy laboratoře, tj. v případě OHBKT ÚVN 1,57 mkat/l.

   Sdělení podává přehled o naměřených hodnotách u dárců krve, tj. vlastně zdravé populace jako celku, dále podle jednotlivých skupin, rozdělených na muže a ženy, vojáky základní služby a ostatní, odběry prováděné v ÚVN Praha a na výjezdech.

 

 

MOLEKULÁRNÍ GENETIKA NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ

 

Mareš J.

ÚBLG II. LF UK Praha

 

   Nádorové onemocnění je soubor chorob, při kterých buňky unikají z dosahu řídících mechanizmů, které za normálních podmínek limitují růst a proliferaci buněk. Nádory jsou výsledkem genetických změn, které ovlivňují buněčný cyklus. Některé geny lidského genomu řídí růst a dělení buněk; jejich náhodné spontánní genetické alterace v somatických buňkách, tzv. mutace, mohou vést ke vzniku a rozvoji nádorů. Významným počinem pro porozumění molekulární podstaty nádorových onemocnění bylo studium nádorů indukovaných viry. Výzkum vedl k objevu genů způsobujících nádorová onemocnění zvaných onkogeny v některých retrovirech. Obecně onkogeny vznikají z protoonkogenů, jejich normálních buněčných protějšků, genetickou změnou, která vede ke zvětšení množství protoonkogenového proteinu nebo zvýšení jejich biologické aktivity. Kromě genů stimulujících růst buněk přispívají ke vzniku nádorových onemocnění i geny, které za normálních podmínek inhibují proliferaci zvané nádorové supresorové geny (antionkogeny). Jejich proteinové produkty za normálních podmínek brání nekontrolovanému buněčnému růstu.

   K rozvoji nádorového onemocnění je obvykle třeba více než jedné somatické mutace, tumorigeneze je vícestupňový proces. Tato skutečnost může vysvětlit zvýšení incidence nádorových onemocnění s rostoucím věkem pacienta. Ku příkladu vznik maligního kolorektálního karcinomu probíhá současně s postupným nahromaděním mutací, které aktivují onkogeny (RAS) a vypínají nádorové supresorové geny (TP53). Na úrovni DNA se musí objevit asi půl tuctu alterací, aby se plně rozvinulo nádorové onemocnění.    

 

 

JAK SE VYVÍJELA LABORATORNÍ MEDICÍNA NA DĚTSKÝCH KLINIKÁCH

V PRAZE

 

Masopust J.

Ústav klinické biochemie a patobiochemie, Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta

 

      Na počátku minulého století se ještě mnoho laboratorních testů nedělalo.  Pravděpodobně jen kvalitativní vyšetření moče nebo mikroskopické vyšetření krve, stolice a močového sedimentu. Kvantitativní chemická analýza vycházela totiž především z metod používaných v průmyslu jako jsou metody vážkové, volumetrické, gasometrické, které vyžadovaly velké množství materiálu. Při aplikaci na biologický materiál to znamenalo nejméně 2 až 10 ml krve na 1 vyšetření; uvážíme-li, že množství krve u nedonošeného novorozence činí v průměru 115 ml/kg hmotnosti, u normálního novorozence 85 – 115 a u kojence 75 – 105 na 1 kg, tak se dětský lékař při získávání informací o nemocném dítěti v Dětské fakultní nemocnici na Karlově, kde jsem začínal svoji kariéru, musel spokojit s anamnézou získanou od rodičů a s fyzikálním vyšetřením. V roce 1920 Dr. Volhardt uváděl, že na tyto dva zdroje vyšetřování připadá  v průměru 90% informací, které lékař může získat o zdravotním stavu pacienta, a že zbytek - 10% tvoří tzv. pomocná vyšetření tj. vyšetření přístrojová a laboratorní. (Dnes je tento poměr skoro obrácený; anamnéza i fyzikální vyšetření některým lékařům nepřipadá, bohužel, tak důležité). Rozvoj kolorimetrických a fotometrických technik rozšířil možnosti analytických metod při vyšetřování biologického materiálu. Na začátku třicátých let minulého století (1931) vyšla vynikající kniha „Clinical Chemistry“ od amerických autorů Peterse a Van Slyka ve dvou dílech – „Methods“ a „Interpretation“, která položila skutečný základ jak analytiky tak interpretce výsledků.biochemických testů. Zakladatelem laboratorních vyšetřovacích metod v tomto pojetí byl u nás profesor Jaroslav Hořejší, asistent kliniky vnitřního lékařství u profesora MUDr Karla Hynka v Praze. Jednotlivé laboratoře při interních odděleních, ale i dětských, vznikaly před  i po 2. světové válce v naší republice na více místech. V roce 1948 došlo k významnému počinu v historii pediatrické klinické biochemie: Na I. dětské klinice profesora Švejcara vznikla Centrální laboratoř, pod vedením tehdejšího asistenta kliniky MUDr. Jiřího Homolky. (Hematologie zůstala i nadále jako příruční laboratoře jednotlivých klinik, bakteriologická a serologická vyšetření se posílala do Bakteriologicko-serologického ústavu Univerzity Karlovy, k prof. Patočkovi). 

 

   Homolkův význam pro rozvoj laboratorní medicíny u nás byl však mnohem větší než sjednocení biochemických laboratoří. On totiž s několika málo spolupracovníky - laboranty vypracoval, odzkoušel a uvedl do praxe mikrometody  (a ultramikrometody). Jejich soubor publikoval nejprve v malé brožuře (1950), později v knižní příručce pod názvem „Chemická diagnostika v dětském věku“ (1956) Tuto publikaci i další rozšířené vydání (dvoudílné) používali všichni laboratorní pracovníci jako „bibli“ laboratorních vyšetřovacích metod nejen u nás, ale v překladech v Polsku a NDR. Na dětských klinikách v Praze se běžně vyšetřovaly v té době i parametry vnitřního prostředí (Na+, K+ emisní plamenovou fotometrií, Cl- merkurimetricky a tzv. alkalická rezerva na Van Slykově manometru). To bylo velmi důležité pro diagnostiku poruch vodního a elektrolytového hospodářství, zejména u kojeneckých průjmů nebo u dětí s diabetickou ketoacidózou.

   Dr. Homolka začínal tuto práci s pěti laboranty a dvěma sanitárkami; za jeden rok (1948) provedli kolem 8000 kvantitativních vyšetření. Když to srovnáme se statistickým výkazem Ústavu klinické biochemie a patobiochemie 2.LF a FNM který je pokračování oné Homolkovy Centrální laboratoře, kde je uvedeno, že bylo v roce 2001  provedeno 2 miliony 415 tisíc analýz s 60-ti pracovníky, neznamená to, že by v roce 1948 měli laboranti málo práce nebo pohodlný laboratorní život. Spíše naopak: slovo "laborant" pochází od latinského laborare, což znamená tvrdě pracovat, protože manuální technika s tehdejšími pomůckami a přístroji, stejně jako analytické metody byly velmi pracné. Mnohdy jedno vyšetření trvalo hodiny i dny. Kupř. stanovení tzv. nebílkovinného (říkalo se zbytkového) dusíku v séru vyžadovalo precipitaci bílkovin, centrifugaci, mineralizaci zahříváním s koncentrovanou kyselinou sírovou v pískové lázni a fotometrické vyhodnocení tzv. nesslerizací. Nebo to čemu se říkalo "jaterní testy" (Weltmannův koagulační pás, Takatova zkouška, kefalin-cholesterolový test), považovali laboranti i myčky za "jaterní tresty", protože to vyžadovalo moc pipetování a moc zkumavek pro jedno vyšetření.

   K jakým změnám docházelo v klinické biochemii průběhu dalšího půlstoletí se pokusíme vylíčit podle rozvoje čtyř hlavních oblastí, v kterých se obor vyvíjel.

   V oblasti analytiky to byla cesta od vícestupňových reakcí trvajících i několik hodin až dní k reakcím jednostupňovým neboli „jednozkumavkovým“. Zároveň byla postupně vyloučena všechna agresivní činidla nebo vysoké reakční teploty, které znemožňovaly použití automatů a byla zaváděna enzymová činidla, která se navíc vyznačovala vysokou specifičností. Mez detekce se snižovala  z oblasti milimolů na úroveň  nanomolů až pikomolů (tj 10-12) popřípadě femtomolů (10-15). Zavedením metod molekulové biologie se postupuvalo ještě dále, k attomolům; dokonce bylo nutné přidat další zlomky – zeptomoly a ještě menší yocttomoly (tj. 10-21 až –24), tedy detekce až jedné molekuly v 10 litrech. Byla zavedena „suchá chemie“, která umožňuje  provádět testy přímo u pacienta. Vypracování imunochemických metod, zejména se značenými reaktanty (jako je RIA, ELISA, EIA, FIA apod.) znamenalo možnost rutinního vyšetřování látek jako jsou hormony a další analyty, vyskytující se jen v nepatrném množství ve velmi komplexní  směsi, jakou je biologický materiál. Převratem v laboratorní technologii byl objev polymerasové řetězové reakce (PCR) a dalších technik DNA a RNA analýzy. Tyto metody umožňují nalézat změny až na molekulové úrovni a odhalit tak skutečnou příčinu nemocí, a tím i možnost adekvátního léčení a vyléčení.  

   V přístrojové technice to byla cesta od manuálních metod přes mechanizaci, vyšší mechanizaci až po automatizaci a robotizaci. Laborant na takových pracovištích sedí před obrazovkou s řídícím panelem, dotýká se tlačítek a zadává tak automatickému analyzátoru, které testy se mají z malého vzorku materiálu provést. Zároveň se přístrojová technika zmenšovala, takže původní velké automaty, které vážily i několik set kilogramů a zabíraly velkou plochu, se nyní vejdou na laboratorní stůl; začíná se používat mikročipová technologie a   dokonce se uvažuje o nanotechnologii, to je laboratoř velikosti zrnka rýže. Velký rozvoj zaznamenaly dělící metody – chomatografie (vysoceúčinnostní kapalinová chromatografie) a elektroforéza: Namísto zdlouhavé a pracné elektroforézy na papírových proužcích se používá kapilární elektroforéza, při níž dělení proteinů i jiných látek trvá několik minut i s vyhodnocením výsledků. Hmotnostní spektrometrie v kombinaci s dělicími technikami umožňuje rozpoznání velké řady látek a jejich kvantifikaci v tak obrovské směsi látek jakou je plasma, moč, extrakty tkání (nádorů). Využití v diagnostice metabolických vad nebo v toxikologii jsou jen příklady možností. Přístroje s iontově selektivními elektrodami pro stanovení Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl- nahrazují plamenové emisní fotometry nebo coulometry. Technologie biosenzorů se také začíná používat rutinně, ale jejich široké použití je teprve očekáváno.

 

   Obrovský rozmach zaznamenala informatika tedy technologie zpracování dat a rozvoj počítačové komunikace. Byla to cesta od „tužky a papíru“, přes logaritmické pravítko a kalkulačky, které se používaly k výpočtům výsledků, k počítačům několika generací s výrazně narůstající pamětí a rychlosti zpracování a se zmenšováním jejich rozměrů i hmotnosti. Budování informačních systému ve zdravotnických zařízeních, jejichž součástí je laboratorní informační systém, stejně jako používání komunikace  pomocí celosvětových sítí jakou je kupř. INTERNET, je dnes samozřejmostí. Neznalost práce s počítačem se považuje za stejný nedostatek jako negramotnost v minulosti.

 

   Velký rozvoj zaznamenala klinická biochemie jako medicínský vědní obor. Za těch 50 let to byla, zjednodušeně řečeno, cesta od Krebsova citrátového cyklu k vysvětlení molekulových mechanismů buněčných funkcí jako je cyklus dělení buňky, programovaný zánik buňky nebo signální transdukce,  a ten nejvýznamnější krok k odhalování podstaty chorobných stavů - bylo zmapování lidského genomu. Otevřela se tak cesta, na jejímž horizontu je zvládnutí takových nemocí jako je rakovina, diabetes, ateroskleróza a choroby s ní spojené, osteoporóza, stejně jako řada dalších dědičných nebo získaných onemocnění - a také cesta k prodloužení funkčního lidského života, stále v dobrém zdraví, který nebude mít současné problémy vyššího věku. Klinická biochemie v tomto vědeckém projektu bude mít jistě významné místo. Je třeba však přesvědčit ty, kteří o tom budou rozhodovat, že: chceme-li jít hlouběji za poznáním, musíme i hlouběji sáhnout do kapsy a že rozhodně je užitečnější věnovat prostředky na zachování života než na jeho ničení.

 

 

NESTABILITA GENOMU NÁDOROVÉ BUŇKY TESTOVANÁ METODAMI

MOLEKULÁRNÍ  CYTOGENETIKY.

 

Michalová K., Zemanová Z.

Centrum nádorové cytogenetiky VFN a 1.LFUK, Ústav klinické biochemie a 

laboratorní diagnostiky, U nemocnice 2, 12808 Praha 2

 

   V nádorové buňce existuje celá škála zásadních změn oproti buňce normální. Důležité z nich jsou  inaktivované geny, přestavěné, nadpočetné nebo chybějící chromosomy a další malé i velké genetické abnormality. Většina vědců souhlasí s tím, že vznik maligních nádorů je spouštěn akumulací několika takových změn, z nichž některé vytváří fúzované geny s novou funkcí, jiné vyřazují z funkce nádorové supresorové geny a jiné aktivují onkogeny. Není však jednotný názor na to, jakou cestou  výchozí nádorové buňky získávají tolik mutací a chromosomových přestaveb.

   Díky klasické nádorové cytogenetice byla v genomu popsána místa častých zlomů a přestaveb chromosomů a to vedlo k identifikaci mnoha genů, které hrají významnou roli v patogenezi nádorů. V současné době existuje řada molekulárně biologických metod, kterými lze otestovat rozdíly v počtu kopií, struktuře a expresi genů  a DNA sekvencí. Molekulární cytogenetika má rozvinuté speciální techniky fluorescenční in situ hybridizace (FISH), komparativní genomové hybridizace (CGH), spektrálního karyotypování (SKY), mnohobarevné FISH  a mnohobarevného pruhování s vysokou resoluční schopností (mBAND). Všechny výše uvedené techniky kromě SKY používáme v naší laboratoři. Uvedeme příklady  jejich využití v klinické cytogenetice i při diagnostice  nejrůznějších typů solidních nádorů a leukémií a zhodnotíme jejich význam při monitorování léčby a stanovení prognózy různých nádorových onemocnění.

   Práce byla podpořena granty IGA MZČR NC-6470- 3, NE -6472-3 a GAČR 301-01-0200.

 

 

VYUŽITÍ TANDEMOVÉ HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE PRO STANOVENÍ

 ACYLKARNITINŮ

 

Myšková H., Vacková M., Chrastina P., Šťastná S.

Ústav dědičných metabolických poruch VFN a 1. LF UK,Ke Karlovu 2,128 08 Praha 2

 

   Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) je metodou volby pro screening dědičných metabolických poruch (DMP). Jejím hlavním přínosem je možnost diagnostikovat několik desítek DMP z jediné suché kapky krve během jedné analýzy a to pro potřeby novorozeneckého i selektivního screeningu. Přednosti MS/MS jsou vysoká senzitivita a specifita, nenáročnost na biologický materiál, možnost vyšetření novorozence 48 hodin po narození, doba analýzy 2,5 minuty, vyšetření až 500 vzorků denně.

   Tandemový hmotnostní spektrometr je jeden z typů analytických přístrojů známých jako hmotnostní spektrometry. Hmotnostní spektrometr měří  „hmotnost molekul“ v ionizovaném stavu. V tandemovém hmotnostním spektrometru jsou umístěny dva hmotnostní spektrometry v tandemu a mezi nimi dochází k rozbití molekuly na fragmenty. Podle jejich spektra lze látky identifikovat. Strukturně podobné látky se v některých fragmentech shodují, např. acylkarnitiny mají společný fragment o hmotnosti 85, aminokyseliny fragment  o hmotnosti 102. To je možné využít pro jejich stanovení ve složité směsi (biologický materiál) bez použití separačních technik. Kvantifikaci  lze provést  použitím látek značených stabilními izotopy.

   Acylkarnitiny jsou estery karnitinu a mastných nebo organických kyselin. Karnitin v buňce přenáší acyly dlouhých mastných kyselin z acyl-CoA přes vnější a vnitřní mitochondriální membránu do matrix mitochondrie, kde se acyl opět naváže na CoA a volný karnitin přejde zpět do extramitochondriálního prostoru.

   Pro novorozenecký screening DMP se zejména používá vyšetření dvou skupin metabolitů – aminokyselin a acylkarnitinů. Z profilu aminokyselin můžeme diagnostikovat různé aminoacidopathie, především fenylketonurii/ hyperfenyl-alaninemii, a z profilu acylkarnitinů různé organické acidurie nebo poruchy b-oxidace mastných kyselin, při kterých jsou z buněk vyplavovány specifické acylkarnitiny. Ty pak můžeme stanovit vyšetřením MS/MS ze suché kapky krve a určit diagnosu, např. methylmalonovou acidémii nebo deficit MCAD (dehydrogenasy středně dlouhých mastných kyselin).

 

Tato práce vznikla za podpory výzkumného záměru  64 165 MZ ČR

 

 

BETA-TRACE PROTEIN – MARKER LIQUORHOEY

 

Nováčková L., Doležil D., Ježková I.

Ústav klinické biochemie, Neurologická klinika,  FNsP Ostrava

 

   Beta-trace protein, označovaný též jako prostaglandinD syntáza, je bílkovina s nízkou molekulovou hmotností 25 kD. Její koncentrace v likvoru je výhradně mozkového původu (hlavním místem syntézy jsou leptomeningy).   Je přítomna i v dalších tělních tekutinách, včetně séra, ovšem v mnohem nižších koncentracích. Koncentrace Beta-trace proteinu v likvoru je 32 x vyšší než v séru. Jeví se tudíž jako výhodný marker při pátrání po přítomnosti likvoru (diferenciální diagnostika liquorhoey).

   Únik likvoru je život ohrožující komplikací (hrozí sepse CNS). Musí být diagnostikován, lokalizován a chirurgicky uzavřen bez ohledu na anatomickou lokalizaci. Únik likvoru může nastat jako následek traumatu, nebo chirurgického zákroku, nebo invaze tumoru. Jen ve výjimečných případech je příčina neznáma. Vzorek dodaný do laboratoře může být sekretem z nosu, z ucha, či punktátem z operační rány.

   Beta-trace protein stanovujeme pomocí reakce antigen protilátka s lasernefelometrickou detekcí (nefelometr BN 100) , soupravou N Latex BTP (DADE Behring), podle firemního návodu. Pro kalibraci používáme vysoce čistý BTP z lidského likvoru (N Protein Standard UY), mezinárodní standard není k dispozici. Přesnost je hlídána použitím N/T Protein Control LC (DADE Behring). Vzorky před stanovením centrifugujeme.

   Soubor 21 pacientů. Z toho: traumata - 12 pacientů, neurochirurgické výkony - 9 pacientů (celkem 34 měření). Nalezené hladiny BTP byly vyhodnoceny spolu s nálezy CT. Nebyl zjištěn ani jeden falešně pozitivní výsledek. Falešně negativní výsledky byly tři – zde šlo spíše o preanalytickou záležitost -  dodáno extrémně malé množství materiálu. 

   Stanovení beta trace proteinu se jeví jako ideální. Je to metoda neinvazivní, vyžaduje pouze malý objem vzorku.  Metoda je snadno proveditelná v rutinním provozu. (samotné stanovení trvá 15 minut). Jisté omezení je u pacientů s renální insuficiencí – pro vyhodnocení je nutné znát hladinu BTP také v séru.

 

 

POKROKY V KLINICKÉ CYTOGENETICE

 

Oltová A.

Oddělení lékařské genetiky, FN Brno, Černopolní 9, 625 00  Brno

 

V době prudkého rozvoje molekulárně biologických metod představují cytogenetická vyšetření nenahraditelnou metodu pro získání informací a celkového přehledu souboru lidských chromozomů na úrovni prenatální i postnatální a v mnoho případech i u maligních onemocnění. Prudký rozvoj cytogenetiky se datuje od roku 1956, kdy byl stanoven přesný počet lidských chromozomů, od roku 1970 jsou publikovány metody k rozlišení jednotlivých chromozomů a jejich úseků a na konci 80. let jsou zaváděny tvz. molekulárně cytogenetické metody.  V prenatálním období jsou cytogenetická vyšetření nabízena těhotným ženám z tzv. geneticky rizikových skupin, kam patří ženy vyššího věku, dále ženy s patologickým nálezem z biochemického nebo ultrazvukového skríningového vyšetření a vždy nositelé vyvážených chromozomálních aberací. V období postnatálním je indikováno stanovení karyotypu např. tam, kde fenotyp jedince vykazuje odchylky naznačující možnost přítomnosti chromozomálních změn, v rodinách s opakujícími se spontánními aborty, partnerům z dysfertilních párů, dárcům gamet, aj. V přednášce budou probrány stručně jednotlivé metody a indikace tak, aby dávaly ucelený obraz o stavu klinické cygenetiky a nejmodernějších metod na zač. 3. tisíciletí.

 

 

DIABETES-SELFMONITORING, POINT-OF-CARE-TESTING. 

GLUKOMETRY - HISTORIE A SOUČASNOST.

 

Omastová K.

Referenční  laboratoř  MZ ČR pro klinickou biochemii  při  Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky  VFN a 1.LF UK Karlovo nám. 32, 121 11  Praha 2

 

Diabetes je nemoc charakterizovaná poruchou regulace hladiny krevního cukru.

Je rozhodně prokázano, že kontrola glykemie může značne snížit riziko rozvoje komplikací spojených s diabetem. V ČR je registrováno 653 000 diabetiků tj. téměř 7% obyvatel. Diabetici mají možnost si kontrolovat glykemii pomocí glukometrů. V této oblasti dochází k velkému rozvoji. Dochází k zdokonalování technologií jak testovácích proužků, glukometrů tak i lancetových per k odběrům krve.

S glukometrem se setkáváme také ve zdravotnických zařízeních (POCT). Zde je velmi důležité dodržování řady zásad pro měření. Důležitý je i výběr glukometru, zaškolení obsluhy a kontroly. Před uvedením na trh v ČR procházejí přístroje ověřením v Referenční  laboratoři pro klin.biochemii.

Za  dobu činnosti Referenční laboratoře jsme měli možnost se seznámit s řadou glukometrů. Na krátkém přehledu seznámíme s glukometry, které jsou na trhu v ČR a s novinkami ze světa.

 

 

KOMPLEXNÍ CERTIFIKACE CELÉ KRAJSKÉ NEMOCNICE

 

Pěkná A., Hálová H.

Oddělení klinické biochemie Masarykovy nemocnice v Ústí n.L.

 

   Management Masarykovy nemocnice v Ústí n.L. se rozhodl připravit k certifikaci komplexně celou nemocnici najednou. První myšlenka padla v r. 2000, na jaře r. 2001 byl vytvořen harmonogram pro zavedení systemu jakosti a poté se začalo pracovat. Nejprve přišlo období tvorby pracovních týmů pro veškeré činnosti v nemocnici, pak následovalo období neustálého proškolování, sbírání zkušeností doma i v zahraničí, neustálých změn a různých úprav, s odstupem doby pak práce na všech frontách včetně přesvědčování zaměstnanců.V procesu přípravy proběhly vnitřní audity na veškerých úsecích, pak předaudit a konečně obávaný externí audit,  prováděný firmou U.R.S. z Velké Britanie. Na jeho doporučení byl nemocnici udělen v prosinci roku 2002 certifikát ISO 9001-2000. Nebylo to vůbec snadné. Výhody i nevýhody komplexně prováděné přípravy k cerifikaci jsou předmětem tohoto sdělení.

 

 

NIS V NÁVAZNOSTI NA LIS V MASARYKOVĚ NEMOCNICI V ÚSTÍ NAD LABEM

 

Pirožáková M., Partlová D.

Oddělení klinické biochemie Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem

 

OKB Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem je součástí nemocnice s 1249 lůžky. Nemocnice včetně našeho oddělení je rozdělena do 2 areálů, od sebe vzdálených 4,5 km. Na OKB užíváme LIS firmy SMS PROGRES - LAN, na klinických odděleních NIS firmy SMS Clinicom.Řadu let  fungovaly vedle sebe NIS a LIS bez vzájemného propojení. Před 2 lety byl ke Clinicomu dokoupen další program , který práci lékařů usnadňuje a zrychluje. Clinicom má dvě uživatelské části, jak pro práci lékaře,tak pro práci sestry. Na OKB funguje LIS v síťové verzi a komunikace s NIS byla započata před 3 lety odesíláním hotových a potvrzených nálezů na klinická oddělení. Teprve v červenci loňského roku se komunikace s NIS rozšířila o používání elektronické žádanky,  zatím bez využití čarového kódu.Oboustranné využívání komunikace NIS s LIS a jeho výhody i úskalí v provozu jsou cílem posteru.

 

 

NOVOROZENECKÝ SCREENING

 

Pokorná L., Reinischová I., Vinohradská H.

FN Brno, pracoviště dětské medicíny, OKBH - novorozenecký screening, Černopolní 9, Brno

 

Obsahem posteru je prezentace laboratoře novorozeneckého screeningu OKBH - pracoviště dětské medicíny FN Brno.

Autorky přibližují problematiku vyšetřování 2 celoplošných novorozeneckých laboratorních screeningů - tj. vyšetřování hladiny TSH pro včasnou diagnostiku kongenitální hypothyreosy a hodnot fenylalaninu pro včasný záchyt pacientů s HPA/PKU. Stručně seznamují s podmínkami odběru a principy stanovení jednotitvých  vyšetření.

Podávají přehled o počtu vyšetřených dětí a pozitivních záchytů za poslední sledované období.

 

 

VYUŽITÍ METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE KE STUDIU POLYMORFISMŮ

KANDIDÁTNÍCH GENŮ

 

Pourová L., Řeháková H., Medová I., Jáchymová M.

Laboratoř molekulární kardiologie ÚKBLD VFN, 1. lékařská fakulta UK Praha

 

   Laboratoř molekulární kardiologie (dříve izotopová) se několik desítek let, mimo jiné, zabývá studiem příčin vzniku hypertenze a kardiovaskulárního onemocnění. Hlavní výzkumná pozornost je dnes obrácena ke studiu polymorfismů (odchylek) tzv. kandidátních genů, tj. genů kódujících produkty, které se fyziologicky účastní určité funkce v organismu, na příklad regulace krevního tlaku. Mezi tyto produkty mohou být zařazeny katecholaminy (tyrosin-hydroxyláza), systém renin-angiotensin (ACE, angiotensinogen) a další vazokonstrikční (endotelin) nebo vazodilatační působky (atriální natriuretický peptid, syntáza oxidu dusnatého NOS).

   Pro demonstraci metod byl zvolen ze 12 vyšetřovaných polymorfismů gen pro endotelovou syntázu oxidu dusnatého eNOS. Gen se nachází na 7q35-36 chromozomu, skládá se z 26 exonů a zaujímá 21 kb. Polymorfismus (894 G na T) jsme vyšetřovali v 7 exonu genu eNOS. Záměna guaninu za tymin v sekvenci DNA vede k záměně kyseliny glutamové za asparágovou v pozici 298 (proto polymorfismus Glu298Asp).

Metody:  1. Izolace DNA z plné krve

 2. Namnožení úseku celého 7. exonu metodou PCR (polymerasová

   řetězová reakce)

               3. Zjišťování polymorfismu pomocí restriktáz  (MboI)

               4. Vizualizace naštípaných fragmentů na agarózovém gelu

Jedním ze specifických cílů grantu GAČR 306/99/0054 “Endoteliální syntáza oxidu dusnatého: Strukturálně-funkční vztahy, polymorfismy a návrh cílených inhibitorů”, bylo studium polymorfismu Glu298Asp genu pro eNOS u různých stádií esenciální hypertenze v české populaci. Grant byl ohodnocen v kategorii A. V Biochemical and Biophysical  Research Communications, 284, 426-430, 2001 byly publikovány výsledky této studie pod nazvem: “ Association of the Glu298Asp polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene with essential hypertension resistant to conventional therapy”.

 

 

LÉČBA DIABETU

 

Prázný M.

III. interní klinika 1. LF UK a VFN, Laboratoř pro endokrinologii a metabolismus

 

   Diabetes mellitus (DM) je heterogenní onemocnění, jehož společným příznakem je hyperglykémie.

   V současné době rozlišujeme diabetes mellitus 1. typu, který je podmíněn autoimunitním zánětem Langerhansových ostrůvků pankreatu a u nehož je absolutní nedostatek endogenního inzulínu, dále diabetes mellitus 2. typu, který bývá častěji spojen s obezitou a u kterého bývá přítomen pouze relativní nedostatek inzulínu. Jako další jednotka je uváděn gestační diabetes mellitus a dále se může DM vyskytovat sekundárně jako příznak u řady onemocnění endokrinních i neendokrinních.

   Stejně jako se liší etiologie jednotlivých forem DM, různí i jeho léčba. V případě DM 1. typu je jediným terapeutickým postupem léčba inzulínem, stejně jako v případě gestačního DM. Inzulín je aplikován injekčně v různých schématech, nejčastěji volíme intenzifikovaný inzulínový režim, který umožňuje flexibilní terapii a kompenzci DM. Používáme prakticky pouze lidský rekombinantní inzulín rychle působící (podávaný jako bolus) nebo s retardovaným účinkem (bazální dávka), nověji jsou k dispozici i analoga inzulínu s rychlým nebo pomalým účinkem. V indikovaných případech může být zvolena léčba pomocí inzulínové pumpy.

   U diabetiků 2. typu je nutno problematiku řešit komplexně. Často se tento typ diabetu vyskytuje u pacientů s tzv. metabolickým sydromem, u něhož bývají přítomny například arteriální hypertenze, nadváha, nebo  poruchy metabolismu lipidů. Proto jsou zásadním léčebným postupem režimová opatření – redukce hmotnosti, dodržování dietních opatření, dostatek fyzické aktivity. Farmakologicky využíváme léčbu pomocí tablet – PAD (perorální antidiabetika). Jedná se preparáty sulfonylurey různých generací, které svým účinkem na sulfonylureový receptor v B-buňkám pankreatu způsobují uvolnění endogenního inzulínu. Některé z nich mají účinek i v periferních tkáních. Metformin je dalším lékem, který je indikován především u obézních pacientů a jeho působení je periferní. Nověji jsou v léčbě DM II. typu využívány i inzulínové senzitizéry (glitazony). Pouze v přísně indikovaných případech volíme léčbu inzulínem v co nejmenších dávkách.

   Pokud se DM vyskytuje jako součást jiných onemocnění, je nutno léčit toto základní onemocnění a v léčbě hyperglykémie volit léčebný postup též tomuto onemocnění odpovídající.

 

 

URČENÍ PROFILU MASTNÝCH KYSELIN  LIPIDŮ LIDSKÉHO SÉRA  POMOCÍ  KOMBINACE TENKOVRSTEVNÉ CHROMATOGRAFIE NA FOLIÍCH MERCK  A KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

 

Rozsypalová H.,  Chmela Z.

Ústav patologické fyziologie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

 

   Profil mastných kyselin v hlavních typech lipidů lidského séra je důležitým zdrojem informací o zastoupení esenciálních polynenasycených mastných kyselin typu (n – 6) a (n – 3) v krvi. Pro tyto analýzy je běžně využíváno spojení technik tenkovrstevné a plynové chromatografie (TLC a GC).

   Cílem této práce bylo zavedení účinné modifikace spojení obou technik, umožňující využití  výhodných separačních vlastností folií Merck pro TLC a GC na kapilární koloně s dostatečně selektivními separačními charakteristikami.

   Metoda vychází z množství 0,4 ml séra, následuje extrakce Folchovým činidlem, zahuštění vzorku a nanesení  na TLC – folii. Pro separaci je užita soustava n-hexan : diethylether : kyselina octová (84 : 15 : 1), po detekci jsou jednotlivé skvrny  odpovídající fosfolipidům  (PL), nesesterikovaným mastným kyselinám (NEFA), triacylglycerolům (TAG), cholesterylesterům (CE) vyškrabány, následuje transesterifikace silikagelu s lipidem na methylestery mastných kyselin pomocí 0,5 M methanolátu sodného s přídavkem toluenu při 50°C. Časové intervaly derivatizace jsou pro jednotlivé lipidy různé  (od 1 h pro PL a TAG po 6 hod pro CE). Po přidání vody , ochlazení a okyselení kyselinou octovou následuje extrakce do n-hexanu, převedení zbytku neesterifikovaných mastných kyselin na methylestery diazomethanem, odpaření dosucha a vhodné naředění vzorku n.hexanem. Frakce NEFA je kysele extrahována přímo  a převedena na methylestery diazomethanem. GC je  prováděna na  plynovém chromatografu 6890N firmy Agilent Technologies (US)  na kapilární koloně Spira KI 60 (Lachema,  ČR), izotermicky při 220° C,  s plamenným, ionizačním detektorem. Signál je zpracováván pomocí  CSW 1,7 software(ECOM, ČR).  Identifikace píků je prováděna pomocí referenčních standardů.

   Metoda umožňuje stanovení profilů MK čtyř nejvýznamnějších tříd lipidů krevního séra, je adaptována na  podmínky běžné laboratoře. Obecně ji lze aplikovat na biologické vzorky nejrůznějšího původu a složení.

 

 

DEZINFEKCE A JEJÍ VYUŽITÍ NA RIZIKOVÝCH PRACOVIŠTÍCH

 

Říhová D.

ÚKBLD  - sérologická laboratoř

 

Sdělení se zabývá definicí a používáním dezinfekčních prostředků ve zdravotnických zařízeních,především v laboratořích a následnou legislativou. Je uveden princip jednotlivých typů dezinfekce,principů působnosti, včetně praktického provádění.Použití jednotlivých typů dezinfekčních  prostředků a jejich účinnosti na biologický materiál,pracovní a úklidové plochy, přístrojovou techniku.Některé z používaných typů dezinfekce,jejich popis,účinnost a provádění kontroly účinnosti.

 

 

LIDSKÝ GENOM

 

Sedláček Z.

Ústav biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol, V úvalu 84, 15006 Praha 5

 

   Pokrok posledních let umožnil zjišťovat sekvence kompletních genomů i u vyšších organismů. Byly sekvenovány nejen genomy několika set druhů virů a bakterií, ale i genomy člověka a myši, ryby fugu, sumky, hlístice, octomilky, komára a kvasinek, a též rostlin huseníčku a rýže. Na přečtení genomů mnoha dalších organismů se pracuje, včetně genomu našeho nejbližšího příbuzného, šimpanze.

   Genom člověka obsahuje asi 35 tisíc genů. To je jen 2-3x více než má genom octomilky, a asi 3x méně, než se dlouho předpokládalo (v učebnicích se uvádí 100 tisíc genů). Do RNA je přepisována asi čtvrtina genomu, ale proteiny kóduje méně než 1.5% DNA. Funkci zbývající 98.5% většiny genomu, asi z poloviny tvořené repetitivními sekvencemi, neznáme. Variabilita sekvence mezi jednotlivými lidmi dosahuje jen 0.1%. Předpokládá se ale, že tyto varianty odpovídají za rozdíly v náchylnosti k chorobám. Úplně porozumět informaci nesené lidským genomem bude trvat ještě dlouhá desetiletí. Genů je sice méně, než se předpokládalo, ale alternativními cestami jejich exprese dochází k tvorbě více různých proteinů z jednoho genu. Exprese genů je složitě regulována a proteinové produkty genů komplikovaně působí na další proteiny a geny. Pochopení sítě těchto interakcí bude velmi obtížné, ale bude nutné pro porozumění mechanismu nemocí a jejich účinnou léčbu. K tomu poslouží široká škála postupů od geneticky orientovaných epidemiologických studií po srovnání genomů člověka a modelových organismů.

   Výzvou je také pochopení mechanismů multifaktoriálních chorob, v jejichž patogenezi hraje roli mnoho genů spolu s faktory vnějšího prostředí. Nemoci jako cukrovka, astma, Alzheimerova choroba a nádorová nebo psychiatrická onemocnění mají pro svůj častý výskyt mnohem větší význam než choroby monogenní, na které se lékařská genetika dodnes soustřeďovala. Na nově poznaných genech založená diagnostika umožní určení predispozice a přesnou klasifikaci a prognózu průběhu chorob. Individualizovaná medicína se soustředí na cílenou prevenci nemocí a na prognózu individuální odpovědi na různé léky. Pochopení molekulárních mechanismů chorob také povede k vývoji zcela nových, účinnějších léčebných postupů včetně terapie genové.

 

 

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V SOUDNÍ SÍNI - DNA JAKO DŮKAZ PRO ŘEŠENÍ SPORNÉHO OTCOVSTVÍ

Sieglová Z, Loudová M., Brdička R.

Ústav hemaologie a krevní transfuze, Národní referenční laboratoř pro DNA diagnostiku, zkušební laboratoř č. 1345 akreditovaná ČIA, U Nemocnice 1, Praha 2

 

   Princip určování biologického otcovství na základě testů DNA spočívá v originalitě DNA profilu každého člověka, který se předává z rodičů na potomky podle zákonů dědičnosti. DNA profil tvoří soubor variabilních úseků DNA, tzv. polymorfizmů různého typu. Bouřlivý vývoj metodik genotypizace těchto mnohoalelických lokusů DNA i prosazování znaků lidského genomu jako důkazového materiálu v občansko-právních a trestných sporech se datuje od poloviny 80-tych let 20. století. V současnosti se používají zejména různé modifikace amplifíkace vybraných polymorfizmů DNA matky, dítěte a domnělého otce pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

   Tento způsob má pro určování otcovství neoddiskutovatelné přednosti. Ta základní spočívá v jednoznačnosti závěru znaleckého posudku - vyloučení, nebo praktickém prokázaní otcovství s pravděpodobností vysoce přesahující 99.9 %. Nespornou výhodou je potřeba minimálního množství i třeba rozpadlé DNA (1 ng - 1 x 10^-9 g) z libovolných jaderných buněk lidského těla. Ve speciálních případech je možné určit otcovství i k dítěti ještě nenarozenému, jehož DNA profil se určí z buněk plodové vody. Poměrně časté jsou i případy, kdy je nutné ověřit možnost otcovství mrtvého muže. Právě díky DNA technologiím vedou k vyřešení těchto sporů dvě cesty: přímá - analýzou DNA ze vzorku jednoznačně identifikované tkáně po zemřelém (buněčné nátěry, tkáň v parafínu, kosti, nehty, vlasy, zuby) a nepřímá - analýzou DNA blízkých pokrevných příbuzných, což se uplatní i v případech, kdy není možné testovat DNA žijícího domnělého otce. Navíc, DNA profilováním je možné objasnit i situace obtížné z genetického hlediska. Jde o blízká příbuzenská spojení včetně incestu, kdy mají matka a domnělý otec dítěte společné předky, nebo z otcovství jsou nařčeni dva muži v blízkém stupni příbuzenství - otec a syn či bratři. Podobně efektivní je DNA analýza když není možné testovat matku dítěte.

   Naše pracoviště poskytuje znalecké posudky z molekulární genetiky již od roku 1992, druhým rokem pak na základě akreditovaných zkoušek. Kvalita naší znalecké činnosti je každoročně ověřována v rámci mezinárodní kontroly jakosti pořádané International Society for Forensic Genetics (ISFG).

 

 

NEUROBORELIOZA A JEJÍ LIKVOROLOGICKÁ DIAGNOSTIKA

 

Sobek O., Adam P., Táborský L., Průcha M., Doležalová M.

Laboratoř pro likvorologii a neuroimunologii, OKBHI Nemocnice Na Homolce, Praha

Oddělení anesteziologie a resuscitace, FTN Praha

 

   Vzhledem k vysokému procentu promořenosti naší populace paměťovými protilátkami proti boreliím, je detekce aktivního zánětlivého procesu v kompartmentu nervového systému klinicky relevantní informace.

    V rámci kompletního vyšetření likvoru v současné době provádíme kromě základního vyšetření sestávajícího  ze stanovení počtu buněk, hladiny glukozy, chloridů a celkové bílkoviny, ještě i zhodnocení cytologické. Dále je možno vyšetřit i podrobný likvorový proteinogram, zahrnující hladiny imunoglobulinů ve třídách IgM, IgG, IgA, včetně stanovení jeich intratekální produkce, skupinu zánětlivých markerů (CRP, Haptoglobin, Transferin, Prealbumin, Orosomukoid), albuminu a fibrinogenu jako markerů komprese, apolipoproteinů ( Apo A-I, AII, Apo B) pro stanovení tkáňové leze, složek komplementu (C3, C4)a inhibitorů proteináz ( ATT III, alfa1- antitrypsin).

   Největší odchylky oproti normě jeví u pacientů s neuroboreliozou  zejména obecně zánětlivé markery (C3 složka komplementu u akutních infekcí, dále typicky haptoglobin, transferin, méně i orosomukoid), a dále apolipoproteiny, jako markery tkáňové destrukce. Jsou zvýšeny i hladiny imunoglobulinů a přítomna jejich intratékální produkce. Jako velmi citlivé se jeví i klasické kvalitativní cytologické vyšetření, s nálezem zpravidla lymfocytární reakce, avšak může být přítomen i obraz aktivace pouze monocyto- makrofagického systému.

   Výše popsané parametry mnozkomíšního moku spolu s pozitivitou antiboreliových protilátek mohou tedy být důležitým argumentem pro zahájení kauzální ATB terapie.

 

 

DIAGNOSTIKA MUTACÍ V GENU TP53 NA DNA ČIPECH

 

Soukupová A., Krutílková V., Sedláček Z.

Ústav biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol, V úvalu 84, 15006 Praha 5

 

   V současné době je zřetelná snaha přecházet při rutinní molekulárně genetické diagnostice na metody, které jsou automatizovatelné, dokáží paralelně analyzovat více parametrů v jednom vzorku, a vyšetřit více vzorků najednou. Tento požadavek platí také při diagnostice na úrovni DNA u dědičných onemocnění, která jsou podmíněna mnoha různými mutacemi v jednom genu.

   Alelově heterogenní je i syndrom Li-Fraumeni, který se vyznačuje autozomálně dominantně dědičnou predispozicí k nádorovým onemocněním. Řada příslušníků jedné rodiny může trpět sarkomy a nádory prsu a mozku, ale i dalšími typy nádorů. Ty se objevují v nízkém věku, často v dětství, a pacienti mohou onemocnět několika malignitami. V některých postižených rodinách se dědí zárodečné mutace v genu TP53. Všechny rizikové osoby z těchto rodin je třeba pravidelně sledovat, a diagnostika zárodečné mutace v genu TP53 může nádorovou predispozici u některých členů rodiny potvrdit a u jiných vyloučit. Mutace v genu TP53 jsou především bodové typu missense (záměna jednoho nukleotidu za jiný vedoucí k záměně jedné aminokyseliny za jinou), a téměř každá rodina nese jinou, tzv. privátní mutaci. Na detekci mutací je proto třeba použít některou z relativně náročných metod jako jsou sekvenování DNA nebo vyšetření na DNA čipech.

   Sekvenování DNA se na našem pracovišti provádí přímo na PCR produktech jednotlivých exonů genu TP53 s využitím automatického fluorescenčního sekvenátoru. Ve spolupráci se zahraničními pracovišti jsme několik našich vzorků vyšetřili také dvěma typy čipových technologií. Jedna metoda využívá alelově specifickou hybridizaci fluorescenčně značených fragmentů zkoumaného vzorku na oligonukleotidy zakotvené na sklíčku. Druhá metoda využívá minisekvenování, tj. připojení jedné ze čtyř různých fluorescenčních značek na konec zakotveného oligonukleotidu v závislosti na sekvenci navázaného fragmentu studovaného vzorku. Obě metody jsou velice elegantní, spolehlivé, rychlé a relativně levné, ale jejich širokému rozšíření brání především absence jednotné platformy, která by umožňovala na jednom systému vyšetřit více medicínsky zajímavých genů podle zájmu konkrétní laboratoře. Podpořeno grantem IGA MZ ČR NC/6513-3.

 

 

DIABETES MELLITUS V ČESKÉ REPUBLICE

 

Škrha J.

III.interní klinika 1.LF UK a VFN, Laboratoř pro endokrinologii a metabolismus, Praha

 

      Diabetes mellitus je onemocnění postihující v současné době přes 6% populace České republiky. Dosavadní vývoj ukazuje, že počet diabetiků se zdvojnásobuje každých 18-20 let. Zatímco v r.1982 bylo v naší republice registrováno asi 350 tisíc diabetiků, v r.2002 jich bylo přes 670 tisíc. Vedle poznaných případů onemocnění existuje dalších 25-30% z tohoto počtu, tedy 150-200 tisíc osob, které o svém postižení diabetem nevědí. Podobná situace existuje v dalších evropských zemích, kdežto v řadě zemí na asijském nebo severo- i jihoamerickém kontinentu je trend ještě horší. Proto Světová zdravotnická organizace hovoří o celosvětové epidemii diabetu. Problém nastává v důsledku chronických komplikací diabetu, které zvyšují nemocnost i úmrtnost diabetické populace. Zatímco se podařilo dosáhnout snížení výskytu ischemické choroby srdeční u nediabetiků, v diabetické populaci tento trend zaznamenán nebyl, kardiovaskulárních onemocnění u této skupiny obyvatelstva stále přibývá. S tím souvisejí i narůstající finanční požadavky na léčbu diabetu, které podle současných odhadů zřetelně převyšují 10% celkového rozpočtu vynakládaného na české zdravotnictví.

      V popředí pozornosti lékařského výzkumu jsou proto též opatření směřující ke zpomalení nežádoucího vývoje diabetu. Zatímco genetické faktory zatím neumíme ovlivnit, obrací se úsilí na způsob života zahrnující stravovací zvyklosti a pohybovou aktivitu. Je totiž zřejmé, že právě nevhodné složení stravy současně s příliš velkým obsahem energie a dále nedostatek pohybu jsou faktory, které se významně podílejí na dosavadním trendu vývoje diabetu. Také údaj, že přes 75% diabetiků trpí nadváhou nebo přímo obezitou, je alarmující. Řada studií ukázala, že zvýšení fyzické aktivity (doporučuje se aspoň 30 minut denně rychlé chůze) vede k poklesu vzniku diabetu (došlo k poklesu až o 50% v populaci s porušenou glukózovou tolerancí, což je zřetelně více, než je možno dosáhnout pomocí léků).

      Prevence diabetu se dostává na čelné místo zdravotních programů ve vyspělých zemích, neboť se jeví jako účinnější, než mnohdy neúspěšný boj s následky diabetu. Také v České republice byl navržen Národní diabetologický program, jehož smyslem je nejen zajištění péče o diabetiky, ale především intenzivní zaměření na prevenci diabetu a jeho komplikací. K tomu je zapotřebí součinnosti nejen zdravotníků, ale především veškerého obyvatelstva s nezbytným pochopením zásad zdravého způsobu života, což bohužel nepřináší současná moderní společnost. Údajů je k dispozici hodně, budou se však muset účinněji využít. Jenom prosazení pohybové aktivity (zcela obyčejné chůze vedle pěstování takových aktivit jako turistika, cyklistika, lyžování na běžkách či plavání) může podstatně přispět ke zlepšení zdravotního stavu naší populace.

 

 

ABECEDA INFORMATIKY V IMUNOCHEMII

 

Štern P.

ÚKBLD VFN a 1. LF UK, Karlovo nám.32, 121 11 Praha 2

 

Abecedou informatiky v každém oboru jsou pojmy, s nimiž se v něm pracuje. Poměrně často se objevuje neznalost významu běžně používaných zkratek, např. Lp(a), nebo pojmů, např. avidita. Edukační přednáška je zaměřena na vysvětlení základní imunochemické terminologie. Jednotlivé pojmy jsou seřazeny abecedně.

Afinita - síla vazby mezi antigenní determinantou a vazebným  místem protilátky. Alotypová variabilita - sekvence aminokyselin L a H  řetězce. Antigen - látka schopná vyvolat v organismu imunitní odpověď, specificky namířenou proti použitému antigenu. Antigenní specifita - schopnost molekuly reagovat se zvláštní  bílkovinou, tzv. specifickou protilátkou. Antisérum - skupina polyklonálních protilátek, které vznikly v  organismu na podnět antigenů Asociační konstanta - rovnovážná konstanta podle Guldberg-Waagova  zákona mezi komplexem antigen-protilátka a jeho reakčními  složkami. Avidita - suma afinit jednotlivých protilátek. Fúze - spojení nádorové buňky myelomu a lymfocytu nebo  plazmatické buňky produkující specifickou protilátku. Hapten - jednoduchá látka obsahující antigenní determinantu, ale  neschopná bez nosiče (zpravidla albuminu) vyvolat imunitní  odpověď. Hybridom - hybridní buňka trvale produkující určitý typ  specifické protilátky. Imunogen - antigen, který vyvolá imunitní odpověď. Imunogenicita - schopnost vyvolávat imunitní odpověď. Imunokomplex - komplex antigenu a protilátky. Konjugát - antigen a marker nebo protilátka a značkovadlo; spojení může být i poměrně pevnou kovalentní vazbou. Marker - značkovadlo určující způsob detekce imunochemické reakce. Monoklonální - soubor protilátek vzniklých z jediné buňky. Protilátka - bílkovina s charakteristickou strukturou, která  vykazuje specifickou vazebnou aktivitu vůči antigenu, na  jehož podnět se   v organismu vytvořila. Specifičnost - schopnost rozeznávat určitý antigen a nevázat se  na látky příbuzné. Titr séra - největší zředění antiséra, které ještě dokáže navázat 50% značeného antigenu. Vazebné místo - polovina N-koncové části lehkého řetězce a čtvrtina N-koncové části těžkého řetězce imunoglobulinu. Variabilita protilátek - je dána specifitou vazby k antigenu.

 

 

POROVNÁNÍ DVOU ZPŮSOBŮ ODBĚRU KAPILÁRNÍ KRVE NA STANOVENÍ

GLYKEMIE  ELEKTROCHEMICKOU METODOU NA ANALYZÁTORU SUPER  G 

 

Ungerová J., Gajdová A.

Ústav klinické biochemie FNsP v Ostravě

 

   Stanovení glykemie elektrochemickou metodou na analyzátoru Super G umožňuje měření v séru, plazmě a plné krvi.

   Cílem naší práce bylo  porovnání  výsledků glykemií stanovených v plazmě  kapilární krve a dále v jejím  hemolyzátu, tedy dvěma způsoby odběru kapilární krve.

První způsob spočívá v odběru několika kapek krve (asi 100 ul) do mikrozkumavky s antikoagulační látkou.  Po centrifugaci do 1 hod. se pipetuje plazma a zředí se systémovým pufrem od firmy Biovendor v poměru 1+50 do mikrozkumavky . Následuje stanovení na Super G.

   Druhým způsobem se pomocí kalibrované kapilárky nabere 20 ul  z kapky krve na prstu pacienta. Naplněná kapilára se vhodí do mikrozkumavky s 1  ml systémového pufru. Po důkladném promíchání v uzavřené zkumavce je získán homogenní hemolyzát, vhodný ke stanovení glykemie na Super G. Poměr ředění krve je stejný jako u plazmy. Tato technika odběru je rozšířena od počátku 90 let zejména v NSR. V České republice byla modifikována Ing. Špačkem  (firma Biovendor) tak, aby byly minimalizovány přímé náklady.

   Byla statisticky hodnocena přesnost a správnost u obou způsobů  odběrů ve fyziologické a patologické oblasti hodnot. Opakovatelnost byla stanovena v pacientské krvi.

   V plazmě byla  poněkud lepší (VK 3,6 % - 3,1%) než v krevním hemolyzátu  (VK 5,3  % - 4,5%). Reprodukovatelnost (přesnost mezi seriema) byla stanovena na analýzách kontrolních vzorků precinorm a precipath (ROCHE) . U prvního způsobu pipetováním byl v precinormu VK 3,2 % , v precipathu VK 2,7%, U druhého způsobu odběru pomocí kalibrované kapilárky byl v precinormu VK 5,4 %  ,v  precipathu VK 3,7% .

   Správnost analýz byla  hodnocena na stejných atestovaných kontrolních sérech. U prvního způsobu odběru byl Bias 2,1% ( atest 5,57 mmol/l)  a Bias 1,5 % (atest 13,1 mmol/l)

   U druhého způsobu odběru byla chyba poněkud vyšší, Bias 2,5%  (atest 5,57) a Bias 1,9% (atest 13,1 mmol/l).

   Pro statistické hodnocení paralelních výsledků dvěma způsoby odběru bylo analyzováno 190 pacientských vzorků. Byly použity tři metody statistického hodnocení, metoda dvouvýběrového párového t-testu, metoda regresní analýzy dle Passing-Babloka a metoda rozdílového grafu dle Altman-Blanda.

   Výsledky stanovené v pipetované  plazmě,  jsou  významně vyšší, než výsledky hodnot glykemií,stanovené v hemolyzované krvi, odebrané kalibrovanou kapilárkou.

 

 

JAK MOHOU PROGRAMY EXTERNÍHO HODNOCENÍ KVALITY OVLIVNIT KVALITU LABORATORNÍCH VÝSLEDKŮ V TERÉNNÍ PRAXI V ČESKÉ REPUBLICE

 

Valík D., Nekulová M., Pecen L., Votavová I.

Oddělení laboratorní medicíny, Masarykův onkol. ústav, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno

 

Cílem naší studie bylo 1) pomocí programů externího hodnocení kvality objektivizovat úroveň práce a aplikaci principů správné laboratorní praxe v laboratořích klinické chemie MOÚ; 2) zhodnotit funkčnost systému vnitřní kontroly kvality prováděné denně v rutinní klinické chemii v naší laboratoři pomocí programu EQA nezávislém na subjektivních i objektivních lokálních vlivech, a 3) z pohledu jednotlivého účastníka různých programů kontroly kvality zhodnotit, v čem jsou programy EQA rozdílné a jak napomáhají laboratoři v monitorování celkové úrovně kvality práce (total quality management). Evaluaci kontrolních cyklů AKS (SEKK s r.o., ČR) a CN3 (College of American Pathologists, USA) jsme provedli pro vápník, chloridy, draslík, sodík, kyselinu močovou, glukosu, cholesterol, kreatinin, ureu a TSH. Analyzovali jsme diference cílových hodnot AKS vzhledem k „definitive method correlated target values“ cyklu CN3, jejichž design umožňuje předpovědět správnost terénní metody na vzorcích pacientů. Z 9 hodnocených metod, u 4 predikoval materiál AKS cílovou hodnotu (vápník, sodík, kyselina močová, cholesterol) významně odlišnou od hodnoty cyklu CN3. Program CAP CN3 Comprehensive Chemistry Survey nám poskytl vazbu našich výsledků na nejrozsáhlejší program hodnocení kvality v klinické chemii. Srovnání našich výsledků českého cyklu AKS s programem CN3 prostřednictvím hodnot korelovaných s definitivní metodou demonstruje, že existuje prostor pro zlepšení jak konstrukce cílových hodnot materiálů používaných v malých (národních) programech externího hodnocení kvality tak i administrace programu EQA tak, aby lépe monitorovaly lokální charakteristiku terénních metod na vzorcích pacientů.

 

 

KOMPLEXNÍ SCREENING ZE VZORKU STOLICE V GASTROENTOROLOGII

 

Vaníčková Z., Kocna P.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK Praha

 

   Komplexní analýza lidské stolice se v současnosti zařazuje do vyšetřovacích algoritmů mnoha onemocnění. Mezi nejčastější analýzy patří stanovení přítomnosti okultního krvácení (OK) ve stolici. Zde v zásadě existují dvě skupiny metod: první zahrnuje metody založené na pseudoperoxidásové reakci hemoglobinu na substrátu guajakové pryskyřice, kdy v případě přítomnosti okultního krvácení dochází ke změně barvy substrátu do modra. Do této skupiny patří především test Haemoccult, doporučený Českou gastroenterologickou společností jako jediný pro populační screening OK ve stolici. U tohoto testu pacient odebírá po dvou vzorcích ze 3 po sobě následujících stolic do odběrového psaníčka. Test Haemoccult má vysokou specificitu, dostatečnou senzitivitu a malé procento falešně pozitvních výsledků. Druhá skupina testů na přítomnost OK ve stolici využívá imunochemického principu, kdy v detekční kazetě jsou navázány protilátky k lidskému hemoglobinu, v případě jeho přítomnosti ve vzorku dojde opět k barevné reakci. Pacient odebírá 1 vzorek stolice do nádobky s transportním médiem. Imunochemické testy mají vysokou senzitivitu, nižší specificitu než Haemoccult a malé množství falešně negativních výsledků – jejich použití je proto doporučeno při negativně postavené klinické indikaci – k vyloučení přítomnosti krvácení do trávicího traktu.

   Dalšími analyty stanovovanými ve stolici jsou pankreatická elastáza I pro evaluaci exokrinní pankreatické funkce (stanovení nevyžaduje žádná omezení v dietě ani vysazení substituční léčby), antigen Helicobacter pylori, pro diagnostiku floridní infekce touto bakterií, je i možnost stanovení antigliadinových slizničních IgA protilátek, pankreatické amylázy, chymotrypsinu a kalprotektinu. Vedle těchto vyšetření je stolice též vyšetřována bakteriologicky, virologicky a parazitologicky. Spektrum dostupných vyšetření se neustále rozšiřuje. Vzhledem ke své neinvazivnosti  je vyšetření exkrementů oblíbené ve veterinární medicíně.

 

 

BUNĚČNÉ KULTURY V TESTOVÁNÍ BIOLOGICKÉ AKTIVITY

 

Vojteková A., Šišková H., Ulrichová J.

Laboratoř buněčných kultur Lékařské fakulty UP, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc

 

Buněčné kultury představují nezastupitelný model v testování biologické aktivity in vitro nejen nových léčiv, ale také nových materiálů a výrobků používaných ve zdravotnické praxi a v kosmetice. Výrobci těchto prostředků jsou vyžadovány akreditované zkoušky v souladu s normou ČSN EN ISO 10993 a ČSN EN ISO 7405. V Laboratoři buněčných kultur LF je prováděno testování cytotoxicity na buněčných liniích myších fibroblastů NIH 3T3 a Balb/c. Akreditovány jsou zkoušky: i) Test přímého kontaktu, ii) Test extraktu (při různých teplotách a délce extrakce), iii) Eluční – MTT test (určené pro pevné nerozpustné vzorky) a iv) Test rozpustných vzorků. U Testu přímého kontaktu je hodnocen mikroskopicky stav buněčné vrstvy (vakuolizace, odlučování buněk, cytolýza) sledováním inkorporace vitálního barviva krystalové violeti do živých buněk a vyhodnocována šířka lýzované zóny a index lýzy.  U zkoušek ii) – iv) se toxicita vzorků (stupeň cytotoxicity) posuzuje pomocí stanovení životnosti buněčné kultury, které se provádí fotometricky MTT testem, který je založen na schopnosti živých buněk redukovat tetrazoliové soli na barevné formazanové produkty. Množství vytvořeného barviva je úměrné metabolické aktivitě a počtu buněk v testovaných podmínkách. Dalšími buněčnými modely využívanými při řešení výzkumných projektů jsou primární kultury potkaních kardiomyocytů, potkaních, prasečích a lidských hepatocytů, lidských gingiválních fibroblastů a buněčné linie endotheliálních buněk (HUVEC) a keratinocytů (HaCaT). Prezentovány budou jednotlivé modely včetně fotografické dokumentace.

 

 

MĚŘENÍ LIPEMICKÝCH VZORKŮ SÉRA POMOCÍ ZKUMAVEK “LIPOCLEAR”

 

Vošvrdová D., Faruzelová I., Kubalová I.

Ústav klinické biochemie, FNsP Ostrava

 

   V naší laboratoři často analyzujeme vzorky pacientů s hyperlipoproteinémií. Vysoká chylosita vzorků interferuje u spektrofotometrických měření některých analytů. Rozhodli jsme se vyzkoušet tzv. “LipoClear” zkumavky ve vzorcích 30 pacientů a porovnat, jak chylozita  ovlivňuje hodnoty měřených analytů

 

 

SCREENINGOVÁ A KONFIRMAČNÍ VYŠETŘENÍ NA SYFILIS V DENNÍ PRAXI

 

Zákoucká  H.

Národní referenční laboratoř pro diagnostiku syfilis,

Dermatovenerologická klinika VFN Praha, U Nemocnice 2, 128 08 Praha 2

 

   Jak ukazuje následující tabulka dříve tak opomíjené, utajované a v důsledku řady medicínských a společenských vlivů i vzácné onemocnění, jakým byla syfilis, se znovu dostává do popředí zájmu kliniků.

Incidence syfilis v ČR 1990 - 2001

 

 

   V praxi se pro diagnostiku využívají především nepřímé testy (tj. sérologické). Vyšetření mohou být indikována klinickými lékaři při podezření na lues nebo v rámci  diferenciální diagnostiky lokálních nebo celkových projevů infekčního onemocnění.Častěji jsou však součástí obligátních vyšetřovacích postupů  nepatologických i patologických stavů. Tyto situace jsou podrobně  citovány ve Věstníku MZ ČR prosinec 1997 (částka 10) – „Standardy léčebných a vyšetřovacích postupů – III.část“.

   Indikacím a významu jednotlivých  sérologických i přímých testů na syfilis se věnuje rovněž  „Metodické doporučení k sérologickému vyšetřování syfilidy“ profesora MUDr.V. Resla, DrSc., Čs. Dermatovanerologie 4/2001.

   Standardní a spolehlivé provedení jak screeningových, tak konfirmačních testů je s ohledem na stigmatizující dopad konečné diagnosy základním požadavkem.

   Konfirmační vyšetření záchytů reaktivních (pozitivních) výsledků jak netreponemových, tak treponemových testů má být prováděno v Národní referenční laboratoři pro diagnostiku syfilis. Rozsah a spolehlivost testů, kterými NRL pro diagnostiku syfilis disponuje, umožní konfirmaci výsledků, posouzení aktivity onemocnění, kontrolu úspěšnosti léčby.Tento postup je vhodný i s ohledem na intenzivnější migraci obyvatelstva (NRL vede celonárodní registr pacientů).

 

 

PŘEHLED MOŽNOSTÍ LIKVOROLOGICKÉ DIAGNOSTIKY

 

Zeman D.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK

 

Indikace odběru vzorku likvoru:

1/ akutní: akutní neuroinfekce, subarachnoidální krvácení (SAK), maligní infiltrace mening

2/ speciální: chronická zánětlivá onemocnění nervového systému, zejm. roztroušená skleróza (RS).

Vyšetřovací metody: základní - vzhled, počet elementů a erythrocytů (ery), kvalitativní cytologie (diferenciace buněk v preparátu), Pandy, celková bílkovina (CB), laktát; glykorhachie + glykémie. Imunochemie (nutné paralelní stanovení v likvoru a séru): albumin, IgG, IgM, (event. IgA) kvantitativně, výpočet kvocientu albuminu (zvýšení = porucha funkce hemato-likvorové bariéry), výpočet lokální syntézy imunoglobulinů (zánětlivé procesy), oligoklonální IgG (zánětlivé procesy, zejm. RS). Výběrové - bakteriologické, specifické protilátky proti infekčním agens, PCR; spektrofotometrie (při podezření na SAK); specifické proteiny CNS, zejm. S100b (zvýšení indikuje tkáňovou destrukci), 14.3.3 a NSE (zvýšení u M. Creutzfeld-Jakob), MBP (aktivní demyelinizace); průkaz asialotransferrinu (detekce likvorhey).

Obvyklé nálezy: hnisavé neuroinfekce - >900/3 elementů, převážně neutrofilních granulocytů, hyperproteinorhachie >2g/l, hypoglykorhachie (<40% glykémie), ­­laktát (>3,5 mmol/l), nehnisavé neuroinfekce – desítky až stovky/3 elementů, přev. lymfocytů, hyperproteinorhachie různého stupně, popř. může chybět, normoglykorhachie, normální nebo hraničně ­laktát (<3,5 mmol/l), SAK – krvavý mok xanthochromní po centrifugaci, oxyhemoglobin a bilirubin ve spektrofotometrické křivce, fagocytované ery v cytologických preparátech. Počet elementů po korekci na ery v časných stadiích někdy zřetelně zvýšen (neutrofilní pleocytóza = nepřímá /nespolehlivá/ časná známka SAK), hyperproteinorhachie různého stupně, glukóza normální nebo mírně ¯, laktát často ­. Maligní infiltrace mening – nález nádorových buněk v cytologických preparátech. Pleocytóza a hyperproteinorhachie různého stupně, popř. může chybět, často hypoglykorhachie, téměř vždy ­­laktát. RS – ³2 oligoklonální IgG v moku bez adekvátního korelátu v séru, vyšetření třeba provést metodou izoelektrické fokusace se specifickou detekcí IgG (evropský konsensus).

 

 

DETEKCE OLIGOKLONÁLNÍCH IGG V SÉRU A LIKVORU - 

LABORATORNÍ PRŮKAZ DG. RS POMOCÍ IZOELEKTRICKÉ FOKUZACE

 

Ženková J.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky LF UK a FN Plzeň, alej Svobody 80, 304 60 Plzeň

 

Úvod:

Průkaz oligoklonálních imunoglobulinů patří mezi základní diferenciálně diagnostické testy, vedle MRI, VEP a klinického obrazu, pro podporu diagnózy roztroušená skleróza mozkomíšní.

Metodika:

Izoelektrická fokuzace na analyzátoru PhastSystem (Pharmacia LKB Biotechnology), dělení provedeno na polyakrylamidovém gelu s pH gradiendem v alkalické oblasti. Fokuzované oligoklonální pruhy jsou detegovány po imunofixaci protilátkou proti lidskému IgG s následným barvením stříbrem též na analyzátoru PhastSystem.

Výsledky:

Hodnocení 5 základních obrazů je doplněno fotografiemi výsledků IEF a cytologickým obrazem u dg. RS.

Závěr:

Výhodnou použité techniky je rychlost, vysoká citlivost a velmi dobrá reprodukovatelnost dána standardními podmínkami fokuzace a především barvením pomocí automatického analyzátoru PhastSystem.

 

 

CYTOSEDIMENTACE A CYTOCENTRIFUGACE PŘI ZHOTOVOVÁNÍ TRVALÉHO PREPARÁTU MOZKOMÍŠNÍHO MOKU

 

Ženková J., Vokounová K.

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky LF UK a FN Plzeň, alej Svobody 80, 304 60 Plzeň

 

Úvod:

Přehled používaných technik pro zhotovování trvalých cytologických preparátů z likvoru

Metodika:

Porovnání použití cytosedimentační techniky v komůrce dle Němečkové (Mikropur, filnace a separace) s cytocentrifugační technikou (StatSpin, IRIS Company, Cytofuge 2)

Výsledky:

Sledování záchytu elementů a morfologie (u cytocentrifugy v závislosti na čase a otáčkách centrifugace). Výsledky jsou dokumentovány fotografiemi cytologických preparátů.

Závěr:

Velmi dobré uplatnění obou zmíněných technik, podstatné snížení objemu vyšetřovaného materiálu při použití cytocentrifugace a při zachování velmi dobré morfologie elementů.